Updegraff Yöntemi Kullanılarak Bitki Biyokütlesinin Kristal Selüloz İçeriğinin Tahmini
Summary
Updegraff yöntemi selüloz tahmini için en yaygın kullanılan yöntemdir. Bu gösterimin temel amacı, bitki biyokütle örneklerinde selüloz içeriğinin tahmini için ayrıntılı bir Updegraff protokolü sağlamaktır.
Abstract
Selüloz, fotosentez ve hücre duvarlarının ana yük taşıyan bileşeni tarafından üretilen dünyadaki en bol polimerdir. Hücre duvarı, güç, sertlik, hücre büyüme hızı ve yönü, hücre şekli bakımı ve biyotik ve abiyotik stresörlerden korunma sağlayarak bitki büyümesinde ve gelişmesinde önemli bir rol oynar. Hücre duvarı öncelikle selüloz, lignin, hemiselüloz ve pektin oluşur. Son zamanlarda bitki hücre duvarları ikinci nesil biyoyakıt ve biyoenerji üretimi için hedeflenmiştir. Özellikle, bitki hücre duvarının selüloz bileşeni selülozik etanol üretimi için kullanılır. Biyokütlenin selüloz içeriğinin tahmini, temel ve uygulamalı hücre duvarı araştırmaları için kritik öneme sahiptir. Updegraff yöntemi basit, sağlam ve bitki biyokütlesinin kristal selüloz içeriğinin tahmin edilmesi için en yaygın kullanılan yöntemdir. Updegraff reaktifi ile tedavi üzerine alkol çözünmeyen ham hücre duvarı fraksiyonu hemiselüloz ve lignin fraksiyonlarını ortadan kaldırır. Daha sonra, Updegraff reaktif dirençli selüloz fraksiyonu, selüloz homopolimerini monomerik glikoz birimlerine hidrolleştirmek için sülfürik asit tedavisine tabi tutulur. Çeşitli glikoz konsantrasyonları kullanılarak bir gerileme hattı geliştirilir ve deneysel örneklerde selüloz hidrolizi üzerine salınan glikoz miktarını tahmin etmek için kullanılır. Son olarak, selüloz içeriği kolorimetrik anthrone testine göre glikoz monomerlerinin miktarına göre tahmin edilmektedir.
Introduction
Selüloz, hem birincil hem de ikincil hücre duvarlarında bulunan hücre duvarlarının birincil yük taşıyan bileşenidir. Hücre duvarı, bitki hücrelerini çevreleyen hücre dışı bir matristir ve öncelikle selüloz, lignin, hemiselüloz, pektin ve matris proteinlerinden oluşur. Bitki biyokütlesinin yaklaşık üçte biri selüloz1’dir ve güç, sertlik, hücre büyüme hızı ve yönü, hücre şekli bakımı ve biyotik ve abiyotik stresörlerden korunma sağlayarak bitki büyümesinde ve gelişmesinde önemli roller oynar. Pamuk lifi% 95 selüloz2 içeriği içerirken, ağaçlar bitki türlerine ve organ türlerine bağlı olarak selülozun% 40 ila% 50’sini içerir3. Selüloz, β-1,4 glikosidik bağ4ile birbirine bağlanan glikoz kalıntılarının bir disakkarit olan tekrarlayan selobioz ünitelerinden oluşur. Selülozik etanol bitki hücre duvarlarında bulunan selülozdan elde edilen glikozdan üretilir5. Selülozik lif, her mikro fibril’in 500-15000 glikoz monomerleri1,6ile çekirdek birim olarak hareket ettiği birkaç mikro fibrilden oluşur. Selüloz homopolimer plazma membran gömülü selüloz synthase kompleksleri (CSC’ler)1,7ile sentezlenmiştir. Bireysel selüloz synthase A (CESA) proteinleri glukan zincirlerini sentezler ve bitişik glukan zincirleri hidrojen bağları ile bağlanarak kristal selülozoluşturur 1,8. Selüloz, iki baskın formla çeşitli kristal formlarda bulunur, selüloz Iα ve selüloz Iβ yerel formlar olarak9. Daha yüksek bitkilerde selüloz Iβ formunda selüloz bulunurken, daha düşük bitki selülozu Iα formundabulunur 10,11. Genel olarak, selüloz bitki hücre duvarlarına güç ve sertlik vermede önemli bir rol oynar.
Birinci nesil biyoyakıtlar öncelikle gıda kaynakları olan mısır nişastası, kamış şekerleri ve pancar şekerlerinden üretilirken, ikinci nesil biyoyakıtlar gıda dışı bitki biyokütle hücre duvar malzemesinden biyoyakıt üretimine odaklanmaktadır12. Kristal selüloz içeriğinin doğru tahmini sadece selüloz biyosentezi ve hücre duvarı dinamikleri üzerine temel araştırmalar için değil, aynı zamanda uygulamalı biyoyakıt ve biyo ürünler araştırmaları için de önemlidir. Bitki biyokütlesinde selülozun tahmini için çeşitli yöntemler geliştirilmiş ve optimize edilmiştir ve Updegraff yöntemi selüloz tahmini için en yaygın kullanılan yöntemdir. Selüloz tahmini için bildirilen ilk yöntem 1908’de Cross ve Bevan tarafından13. Yöntem, sodyum sülfat ile alternatif klorlama ve ekstraksiyon prensibine dayanıyordu. Bununla birlikte, Cross ve Bevan yönteminin orijinal ve değiştirilmiş protokolleri tarafından elde edilen selüloz, önemli miktarda kslan ve mannans14’eek olarak lignin küçük fraksiyonlarının kirlenmesini gösterdi. Lignin ve hemiselülozları selüloz fraksiyonundan çıkarmak için yapılan çeşitli değişikliklere rağmen, Cross-Bevan yöntemi selülozla birlikte önemli miktarda mannan tuttu. Daha sonra Kurschner’in yöntemi selüloz çıkarmak için nitrik asit ve etanol kullanarak geliştirilmiştir15. Bu yöntemde total lignin ve pentosanların %75’inin çıkarıldığı ancak gerçek selüloz sonuçlarının Cross ve Bevan klorlama yöntemi ile tahmin edilenlerle aynı olduğu belirtilmiştir. Başka bir yöntem (Norman ve Jenkins) selüloz çıkarmak için metanol-benzen, sodyum sülfat ve sodyum hipoklorit kullanarak geliştirilmiştir16. Bu yöntem ayrıca lignin bazı fraksiyonunu da korudu (%3) ve selülozun doğru tahmin edilmesine yol açan önemli miktarda pentosan. Daha sonra, Kiesel ve Semiganowsky% 80 konsantre sülfürik asit kullanarak selülozu hidrolize etmek için farklı bir yaklaşım kullandılar ve hidrolizlenmiş azaltılmış şekerler Bertrand’ın yöntemi ile tahmin edildi17. Kiesel ve Semiganowsky’nin yöntemine dayanarak geliştirilen Waksman’s ve Stevens18ve Salo 14 ,19 olmak üzere iki yöntem, önceki yöntemlere kıyasla % 4-5 daha az selüloz içeriği sağladı20.
Updegraff yöntemi, kristal selüloz içeriğinin tahmin edilmesi için en yaygın kullanılan yöntemdir. Bu yöntem ilk olarak Updegraff tarafından 1969 yılında selüloz ölçümü içintanımlanmıştır 21. Updegraff yöntemi Kurschner yöntemini (nitrik asit kullanımı), Kiesel ve Seminowsky yöntemlerini (selülozun sülfürik asit kullanarak glikoz monomerlerine hidrolizi) ve glikoz ve kristal selüloz içeriğinin basit kolorimetrik tahmini için Viles ve Silverman’ın antroni tahlilini entegre eder22. Bu yöntemin prensibi, daha fazla işleme ve tahmin için asetik/nitrik aside dirençli selüloz bırakan homojen bitki dokularından hemiselüloz ve lignin ortadan kaldırmak için asetik asit ve nitrik asit (Updegraff reaktifi) kullanılmasıdır15. Asetik/nitrik aside dirençli selüloz, selülozu glikoz monomerlerine kırmak için% 67 sülfürik asit ile tedavi edilir ve salınan glikoz monomerleri anthrone tahlil21,23. Prosedürü ve selüloz tahminini anthrone tahlil24ile basitleştirmek için orijinal Updegraff yönteminin çeşitli modifikasyonları kullanılmıştır. Genel olarak, bu yöntem beş aşamaya ayrılabilir. İlk aşamada, bitki malzemesi hazırlanır. İkinci aşamada, selüloz bitki hücre duvarlarının anahtar bileşeni olduğu için ham hücre duvarı toplam biyokütleden ayrılır. Daha sonra üçüncü fazda selüloz, Updegraff reaktifi ile tedavi ederek selüloz olmayan hücre duvarı bileşenlerinden ayrılır. Dördüncü evrede asetik/nitrik aside dirençli selüloz sülfürik asit tedavisi ile glikoz monomerlerine ayrılır. Selülozun sülfürik asit tedavisi, glikotik monomerlerin sülfürik asit ile reaksiyonundan 5-hidroksimetilfurfural bileşiklerin oluşumu ile sonuçlanır. Son olarak, son aşamada, anthrone önceki faz25’teüretilen furfural bileşik ile kaynatılarak yeşilimsi mavi bir kompleks oluşturur. Bu anthrone tabanlı kolorimetrik yöntem ilk olarak 1942 yılında Dreywood tarafından kullanılmıştır. Antroron, asidik koşullar altında 5-hidroksimetilfurfural gibi pentoz ve altıgen susuz ürünlerin furfural bileşiklerini tanımlayan bir boyadır. Altıgen ile reaksiyon pentozlara kıyasla yoğun bir renk ve daha iyi tepki üretir25. Bağlı glikoz miktarı 620 nm’de spektrofotometre emilimi ile ölçülür ve yeşilimsi mavi kompleksin yoğunluğu numunedeki şeker miktarı ile doğru orantılıdır. Ölçülen absorbans değerleri, numunenin glikoz konsantrasyonunu hesaplamak için bir glikoz standart eğri gerileme hattı ile karşılaştırıldı. Ölçülen glikoz içeriği, bitki biyokütlesinin selüloz içeriğini tahmin etmek için kullanılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pamuk lifleri pamuklu elyaftan üretilen doğal liflerdir. Pamuk lifi, tekstil endüstrisindeki kapsamlı uygulamaları ile yüksek kristal selüloz içeriğine sahip ~% 95 selüloz içeriği2 olan tek bir hücredir31. Pamuk lifi ~ % 95 selüloz içerdiğinden, kristal selüloz içeriğinin tahmininin gösterimi için pamuk kök dokuları kullandık. Pamuk kök dokuları kristal selüloz içeriği bakımından orta derecede zengindir ve yaygın olarak bulunan bir bitki biyo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bitki ve Toprak Bilimi Bölümü ve Pamuk A.Ş.’ye bu çalışmaya verdikleri kısmi destek için teşekkür ederiz.
Materials
| Acetone | Fisher Chemical | A18-500 | Used in the protocol |
| Anthrone | Sigma Aldrich | 90-44-8 | For colorimetric assay |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | For centrifugation |
| Chloroform | Mallinckrodt | 67-66-3 | Used in the protocol |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | 6381-92-6 | Used in the protocol |
| Ethanol | Millipore Sigma | EM-EX0276-4S | Used in the protocol |
| Filter paper | Whatman | 1004-090 | Positive control |
| Glacial acetic acid | Sigma | SKU A6283 | Used in the protocol |
| Heat block/ ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 13527550 | For controlled temperatures |
| Incubator | Fisherbrand | 150152633 | Used for drying plant sample |
| Measuring Scale | Mettler Toledo | 30243386 | For specific quantities |
| Methanol 100 % | Fisher Chemical | A412-500 | Used in the protocol |
| Microplate (96 well) | Evergreen Scientific | 222-8030-01F | For anthrone assay |
| Nitric acid | Sigma Aldrich | 695041 | Used in the protocol |
| Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes | BioSpec Products | 10831 | For high temperatures |
| Spectrophotometer(Multimode Detector) | Beckmancoulter DTX880 | 1000814 | For measuring absorbances |
| Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill | Spex Sample Prep | 68-701-15 | For grinding plant tissues into fine powder |
| Sulphuric acid | J.T.Baker | 02-004-382 | Used in the protocol |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | 151-21-3 | Used in the PSB buffer |
| Tubes (2 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | Used in the protocol |
| Tris Hydrochloride | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | Used in the PSB buffer |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977 | Used in the protocol |
| Vacuum dryer (vacufuge plus) | Eppendorf | 22820001 | For drying samples |
| Vortex mixer | Fisherbrand | 14-955-151 | For mixing |
| Waterbath | Thermoscientific | TSGP02PM05 | For temperature controlled conditions at specific steps |
| Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12A | Used in the protocol |
References
- Somerville, C. Cellulose synthesis in higher plants. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 53-78 (2006).
- Balasubramanian, V. K., Rai, K. M., Thu, S. W., Hii, M. M., Mendu, V. Genome-wide identification of multifunctional laccase gene family in cotton (Gossypium spp.); expression and biochemical analysis during fiber development. Scientific Reports. 6, 34309 (2016).
- Mendu, V., et al. Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production. Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).
- Kraszkiewicz, A., Kachel-Jakubowska, M., Lorencowicz, E., Przywara, A. Influence of cellulose content in plant biomass on selected qualitative traits of pellets. Agriculture and Agricultural Science Procedia. 7, 125-130 (2015).
- Jordan, D. B., et al. Plant cell walls to ethanol. Biochemical Journal. 442, 241-252 (2012).
- Brett, C. T. Cellulose microfibrils in plants: biosynthesis, deposition, and integration into the cell wall. International Review of Cytology. 199, 161-199 (2000).
- Li, S., et al. Cellulose synthase complexes act in a concerted fashion to synthesize highly aggregated cellulose in secondary cell walls of plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 11348-11353 (2016).
- Polko, J. K., Kieber, J. J. The regulation of cellulose biosynthesis in plants. The Plant Cell. 31, 282-296 (2019).
- Brown, R. M. The biosynthesis of cellulose. Journal of Macromolecular Science, Part A. 33, 1345-1373 (1996).
- Gautam, S. P., Bundela, P. S., Pandey, A. K., Jamaluddin, M. K., Sarsaiya, A., Sarsaiya, S. A review on systematic study of cellulose. Journal of Applied and Natural Science. 2, (2010).
- Coughlan, M. P. Enzymic hydrolysis of cellulose: An overview. Bioresource Technology. 39, 107-115 (1992).
- Robak, K., Balcerek, M. Review of second generation bioethanol production from residual biomass. Food Technology and Biotechnology. 56, 174-187 (2018).
- Cross, C. F., Bevan, E. J. Cellulose and chemical industry. Journal of the Society of Chemical Industry. 27, 1187-1193 (1908).
- Paloheimo, L., Eine, H., Kero, M. L. A method for cellulose determination. Agricultural and Food Science. 34, (1962).
- Kurschner, K., Hanak, A., Diese, Z. . Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung. 59, 448-485 (1930).
- Norman, A. G., Jenkins, S. A new method for the determination of cellulose, based upon observations on the removal of lignin and other encrusting materials. Biochemical Journalournal. 27, (1933).
- Kiesel, A., Semiganowsky, N. Cellulose-Bestimmung durch quantitative verzuckerung. Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft (A and B Series). 60, 333-338 (1927).
- Waksman, S. A. S., et al. A system of proximate chemical analysis of plant materials. Industrial Engineering Chemistry and Analytical Edition. 2, 167-173 (1930).
- Salo, M. -. L. Determination of carbohydrates in animal foods as seven fractions. Agricultural and Food Science. , 32-38 (1961).
- Giger-Reverdin, S. Review of the main methods of cell wall estimation: interest and limits for ruminants. Animal Feed Science and Technology. 55, 295-334 (1995).
- Updegraff, D. M. Semimicro determination of cellulose inbiological materials. Analytical Biochemistry. 32, 420-424 (1969).
- Viles, F. J., Silverman, L. Determination of starch and cellulose with anthrone. Analytical Chemistry. 21, 950-953 (1949).
- Scott, T. A., Melvin, E. H. Determination of dextran with anthrone. Analytical Chemistry. 25, 1656-1661 (1953).
- Kumar, M., Turner, S. Protocol: a medium-throughput method for determination of cellulose content from single stem pieces of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 11, 46 (2015).
- Yemm, E. W., Willis, A. J. The estimation of carbohydrates in plant extractsby anthrone. Biochemical Journal. 57, 508-514 (1954).
- Houston, K., Tucker, M. R., Chowdhury, J., Shirley, N., Little, A. The plant cell wall: A complex and dynamic structure as revealed by the responses of genes under Stress conditions. Frontiers in Plant Science. 7, (2016).
- Jiang, G., et al. Biomass extraction using non-chlorinated solvents for biocompatibility improvement of polyhydroxyalkanoates. Polymers. 10, 731 (2018).
- Li, T., et al. A saponification method for chlorophyll removal from microalgae biomass as oil feedstock. Marine Drugs. 14, 162 (2016).
- Wiltshire, K. H., Boersma, M., Möller, A., Buhtz, H. Extraction of pigments and fatty acids from the green alga Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae). Aquatic Ecology. 34, 119-126 (2000).
- Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. Comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part II: carbohydrates. Journal of Visualized Experiments. (1837), (2010).
- Haigler, C., Betancur, L., Stiff, M., Tuttle, J. Cotton fiber: a powerful single-cell model for cell wall and cellulose research. Frontiers in Plant Science. 3, (2012).
- Spirk, S., Nypelö, T., Kontturi, E. Editorial: Biopolymer thin films and coatings. Frontiers in Chemistry. 7, (2019).
- Long, L. -. Y., Weng, Y. -. X., Wang, Y. -. Z. Cellulose aerogels: Synthesis, applications, and prospects. Polymers. 10, 623 (2018).
