تقدير محتوى السليلوز البلوري للكتلة الحيوية النباتية باستخدام طريقة Updegraff
Summary
طريقة Updegraff هي الطريقة الأكثر استخداما لتقدير السليلوز. الغرض الرئيسي من هذا العرض هو توفير بروتوكول Updegraff مفصل لتقدير محتوى السليلوز في عينات الكتلة الحيوية النباتية.
Abstract
السليلوز هو البوليمر الأكثر وفرة على الأرض التي تم إنشاؤها بواسطة التمثيل الضوئي والمكون الرئيسي الحاملة لجدران الخلايا. جدار الخلية يلعب دورا هاما في نمو النبات والتنمية من خلال توفير القوة, صلابة, معدل واتجاه نمو الخلايا, صيانة شكل الخلية, والحماية من الضغوطات الحيوية والأحيائية. يتكون جدار الخلية في المقام الأول من السليلوز واللجنين والهيميسليلوز والبكتين. وقد استهدفت مؤخرا جدران الخلايا النباتية لإنتاج الجيل الثاني من الوقود الحيوي والطاقة الحيوية. على وجه التحديد ، يتم استخدام مكون السليلوز في جدار الخلية النباتية لإنتاج الإيثانول السليولوزي. تقدير محتوى السليلوز من الكتلة الحيوية أمر بالغ الأهمية للبحوث الأساسية والتطبيقية جدار الخلية. طريقة Updegraff بسيطة وقوية ، والأسلوب الأكثر استخداما لتقدير محتوى السليلوز البلوري للكتلة الحيوية النباتية. الكحول غير قابل للذوبان كسر جدار الخلية الخام عند العلاج مع كاشف Updegraff يزيل كسور الهيميسيللوز واللجنين. في وقت لاحق ، يتعرض كسر السليلوز المقاوم للكواشف Updegraff لعلاج حمض الكبريتيك لتحلل هوموبوليمر السليلوز إلى وحدات الجلوكوز أحادية الرقمية. يتم تطوير خط الانحدار باستخدام تركيزات مختلفة من الجلوكوز ويستخدم لتقدير كمية الجلوكوز المنبعثة من التحلل المائي للسليلوز في العينات التجريبية. وأخيرا، يقدر محتوى السليلوز على أساس كمية مونومرات الجلوكوز عن طريق فحص الألوان.
Introduction
السليلوز هو المكون الأساسي الحامل لجدران الخلايا ، والذي يوجد في جدران الخلايا الأولية والثانوية على حد سواء. جدار الخلية هو مصفوفة خارج الخلية تحيط بالخلايا النباتية وتتكون في المقام الأول من السليلوز واللجنين والهيميسليلوز والبكتين وبروتينات المصفوفة. ما يقرب من ثلث الكتلة الحيوية النباتات هو السليلوز1 ويلعب أدوارا هامة في نمو النبات والتنمية من خلال توفير القوة، والصلابة، ومعدل واتجاه نمو الخلايا، وصيانة شكل الخلية، والحماية من الضغوطات الحيوية والأحيائية. تحتوي ألياف القطن على 95٪ من محتوى السليلوز2، في حين تحتوي الأشجار على 40٪ إلى 50٪ من السليلوز اعتمادا على أنواع النباتات وأنواع الأعضاء3. ويتكون السليلوز من تكرار وحدات من cellobiose، وهو disaccharide من بقايا الجلوكوز متصلة β-1،4 السندات الجليكوسيدية4. يتم إنتاج الإيثانول السليولوزي من الجلوكوز المستمدة من السليلوز الموجودة في جدران الخلايا النباتية5. تتكون الألياف السليلوزية من عدة الفيبريلات الدقيقة التي يعمل فيها كل الفيبريل الدقيق كوحدة أساسية مع 500-15000 مونومر الجلوكوز1،6. يتم تصنيعها homopolymer السليلوز بواسطة غشاء البلازما جزءا لا يتجزأ من مجمعات synthase السليلوز (CSC)1،7. البروتينات الفردية synthase السليلوز A (CESA) توليف سلاسل الجلوكان وترتبط سلاسل الجلوكان المجاورة من قبل السندات الهيدروجين لتشكيل السليلوز البلوري1،8. السليلوز موجود في عدة أشكال بلورية مع شكلين السائدة, السليلوز Iα والسليلوز Iβ كما الأشكالالأصلية 9. في النباتات العالية، السليلوز موجود في شكل السليلوز Iβ بينما يوجد السليلوز النباتي السفلي في شكل Iα10،11. عموما، يلعب السليلوز دورا هاما في نقل القوة والصلابة إلى جدران الخلايا النباتية.
يتم إنتاج الجيل الأول من الوقود الحيوي في المقام الأول من نشا الذرة ، سكر القصب ، وسكرات البنجر ، وهي مصادر غذائية ، في حين يركز الجيل الثاني من الوقود الحيوي على إنتاج الوقود الحيوي من مواد جدار خلية الكتلة الحيوية النباتية غير الغذائية12. التقدير الدقيق لمحتوى السليلوز البلوري ليس مهما فقط للأبحاث الأساسية حول التمثيل الحيوي للسليلوز وديناميكيات جدار الخلية ولكن أيضا لأبحاث الوقود الحيوي والمنتجات الحيوية التطبيقية. وقد تم تطوير أساليب مختلفة وتحسينها لتقدير السليلوز في الكتلة الحيوية النباتية، وطريقة Updegraff هي الطريقة الأكثر استخداما على نطاق واسع لتقدير السليلوز. وكان أول طريقة المبلغ عنها لتقدير السليلوز من قبل الصليب وبيفان في 190813. واستندت هذه الطريقة إلى مبدأ الكلورة البديلة والاستخراج بواسطة كبريتات الصوديوم. ومع ذلك، أظهر السليلوز التي تم الحصول عليها من قبل بروتوكولات الأصلي وكذلك تعديل الصليب وطريقة بيفان تلوث أجزاء صغيرة من اللجنين بالإضافة إلى كمية كبيرة من الزيان وmannans14. على الرغم من العديد من التعديلات لإزالة اللجنين والهيميسليلوز من كسر السليلوز ، احتفظت طريقة Cross-Bevan بكمية كبيرة من المنانات جنبا إلى جنب مع السليلوز. في وقت لاحق، تم تطوير طريقة كورشنر من خلال استخدام حمض النيتريك والإيثانول لاستخراج السليلوز15. وذكرت هذه الطريقة أن مجموع اللجنين و 75٪ من البنتوسان تمت إزالتهما ولكن نتائج السليلوز الحقيقية كانت هي نفسها التي قدرت بطريقة الكلورة من الصليب وبيفان. تم تطوير طريقة أخرى (نورمان وجينكينز) من خلال استخدام الميثانول البنزين، كبريتات الصوديوم، وهيبوكلوريت الصوديوم لاستخراج السليلوز16. واحتفظت هذه الطريقة أيضا بجزء من اللجنين (3٪) وكميات كبيرة من pentosans مما يؤدي إلى تقدير دقيق للسليلوز. في وقت لاحق، استخدم كيسل وسيميجانوسكي نهجا مختلفا لتحلل السليلوز باستخدام حمض الكبريتيك المركز بنسبة 80٪، وقدرت السكريات المخفضة المتحللة بطريقةبرتراند 17. الطريقتين، واكسمان وستيفنز18 وسالو14،19 التي تم تطويرها على أساس طريقة كيسل وسيميجانوسكي، أسفرت أيضا 4-5٪ محتوى السليلوز أقل مقارنة مع الأساليب السابقة20.
طريقة Updegraff هي الطريقة الأكثر استخداما على نطاق واسع لتقدير محتوى السليلوز البلوري. وقد وصفت هذه الطريقة لأول مرة من قبل Updegraff لقياس السليلوز في 196921. طريقة Updegraff يدمج طريقة Kurschner (استخدام حمض النيتريك) ، Kiesel وطرق Seminowsky (التحلل المائي للسليلوز في مونومر الجلوكوز باستخدام حمض الكبريتيك) مع بعض التعديلات ، ونقيض anthrone من Viles وسيلفرمان لتقدير colorimetric بسيطة من الجلوكوز والبلورية محتوى السليلوز22. مبدأ هذه الطريقة هو استخدام حمض الخليك وحمض النيتريك (كاشف Updegraff) للقضاء على الهيميسليلوز واللجنين من الأنسجة النباتية المتجانسة ، مما يترك السليلوز المقاوم لحمض الخليك / النيتريك لمزيد من المعالجة وتقدير15. يتم التعامل مع السليلوز المقاوم لحمض الخليك / النيتريك مع حمض الكبريتيك 67٪ لكسر السليلوز إلى مونومرات الجلوكوز وتقدر مونومرات الجلوكوز الصادرة عن طريق المقايسة21،23. تم استخدام العديد من التعديلات على طريقة Updegraff الأصلية لتبسيط الإجراء وتقدير السليلوز عن طريق المقايسةanthrone 24. بشكل عام، يمكن تقسيم هذه الطريقة إلى خمس مراحل. في المرحلة الأولى، يتم إعداد المواد النباتية. في المرحلة الثانية ، يتم فصل جدار الخلية الخام عن الكتلة الحيوية الإجمالية ، حيث أن السليلوز هو المكون الرئيسي لجدران الخلايا النباتية. في وقت لاحق ، في المرحلة الثالثة ، يتم فصل السليلوز عن مكونات جدار الخلية غير السليلوزية عن طريق العلاج بكواشف Updegraff. في المرحلة الرابعة ، يتم تقسيم السليلوز المقاوم لحمض الخليك / النيتريك إلى مونومرات الجلوكوز عن طريق علاج حمض الكبريتيك. ينتج عن علاج حمض الكبريتيك للسليلوز تكوين مركبات 5-hydroxymethylfurfural من تفاعل مونومر الجلوكوز مع حمض الكبريتيك. وأخيرا، في المرحلة الأخيرة، يولد النطور مجمع أزرق مخضر عن طريق الغليان مع المركب الفروفي الذي تم إنشاؤه في المرحلة السابقة25. تم استخدام هذه الطريقة الملونة القائمة على المخلع لأول مرة في عام 1942 من قبل دريوود. Anthrone هو صبغة تحدد المركبات الفروية من المنتجات المجففة بنتوز والهيكسوز مثل 5-هيدروكسي ميثيلفورفورال، في ظل ظروف حمضية. رد فعل مع hexose تنتج لون مكثفة واستجابة أفضل بالمقارنة مع pentoses25. يتم قياس كمية الجلوكوز المقيد بامتصاص الطيف الضوئي عند 620 نانومتر وتتناسب كثافة المركب الأزرق الأخضر بشكل مباشر مع كمية السكر في العينة. تمت مقارنة قيم الامتصاص المقاسة بخط انحدار منحنى معيار الجلوكوز لحساب تركيز الجلوكوز للعينة. تم استخدام محتوى الجلوكوز المقاس لتقدير محتوى السليلوز للكتلة الحيوية النباتية.
Protocol
Representative Results
Discussion
ألياف القطن هي ألياف طبيعية تنتج من بذور القطن. ألياف القطن هي خلية واحدة مع ~ 95٪ محتوى السليلوز2 مع محتوى السليلوز البلوري عالية مع تطبيقات واسعة النطاق في صناعة النسيج31. كما, ألياف القطن يحتوي على ~ 95٪ السليلوز, لقد استخدمنا القطن الأنسجة الجذرية للمظاهرة من تقدي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر قسم علوم النبات والتربة والقطن على دعمهم الجزئي لهذه الدراسة.
Materials
| Acetone | Fisher Chemical | A18-500 | Used in the protocol |
| Anthrone | Sigma Aldrich | 90-44-8 | For colorimetric assay |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | For centrifugation |
| Chloroform | Mallinckrodt | 67-66-3 | Used in the protocol |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | 6381-92-6 | Used in the protocol |
| Ethanol | Millipore Sigma | EM-EX0276-4S | Used in the protocol |
| Filter paper | Whatman | 1004-090 | Positive control |
| Glacial acetic acid | Sigma | SKU A6283 | Used in the protocol |
| Heat block/ ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 13527550 | For controlled temperatures |
| Incubator | Fisherbrand | 150152633 | Used for drying plant sample |
| Measuring Scale | Mettler Toledo | 30243386 | For specific quantities |
| Methanol 100 % | Fisher Chemical | A412-500 | Used in the protocol |
| Microplate (96 well) | Evergreen Scientific | 222-8030-01F | For anthrone assay |
| Nitric acid | Sigma Aldrich | 695041 | Used in the protocol |
| Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes | BioSpec Products | 10831 | For high temperatures |
| Spectrophotometer(Multimode Detector) | Beckmancoulter DTX880 | 1000814 | For measuring absorbances |
| Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill | Spex Sample Prep | 68-701-15 | For grinding plant tissues into fine powder |
| Sulphuric acid | J.T.Baker | 02-004-382 | Used in the protocol |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | 151-21-3 | Used in the PSB buffer |
| Tubes (2 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | Used in the protocol |
| Tris Hydrochloride | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | Used in the PSB buffer |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977 | Used in the protocol |
| Vacuum dryer (vacufuge plus) | Eppendorf | 22820001 | For drying samples |
| Vortex mixer | Fisherbrand | 14-955-151 | For mixing |
| Waterbath | Thermoscientific | TSGP02PM05 | For temperature controlled conditions at specific steps |
| Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12A | Used in the protocol |
References
- Somerville, C. Cellulose synthesis in higher plants. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 53-78 (2006).
- Balasubramanian, V. K., Rai, K. M., Thu, S. W., Hii, M. M., Mendu, V. Genome-wide identification of multifunctional laccase gene family in cotton (Gossypium spp.); expression and biochemical analysis during fiber development. Scientific Reports. 6, 34309 (2016).
- Mendu, V., et al. Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production. Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).
- Kraszkiewicz, A., Kachel-Jakubowska, M., Lorencowicz, E., Przywara, A. Influence of cellulose content in plant biomass on selected qualitative traits of pellets. Agriculture and Agricultural Science Procedia. 7, 125-130 (2015).
- Jordan, D. B., et al. Plant cell walls to ethanol. Biochemical Journal. 442, 241-252 (2012).
- Brett, C. T. Cellulose microfibrils in plants: biosynthesis, deposition, and integration into the cell wall. International Review of Cytology. 199, 161-199 (2000).
- Li, S., et al. Cellulose synthase complexes act in a concerted fashion to synthesize highly aggregated cellulose in secondary cell walls of plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 11348-11353 (2016).
- Polko, J. K., Kieber, J. J. The regulation of cellulose biosynthesis in plants. The Plant Cell. 31, 282-296 (2019).
- Brown, R. M. The biosynthesis of cellulose. Journal of Macromolecular Science, Part A. 33, 1345-1373 (1996).
- Gautam, S. P., Bundela, P. S., Pandey, A. K., Jamaluddin, M. K., Sarsaiya, A., Sarsaiya, S. A review on systematic study of cellulose. Journal of Applied and Natural Science. 2, (2010).
- Coughlan, M. P. Enzymic hydrolysis of cellulose: An overview. Bioresource Technology. 39, 107-115 (1992).
- Robak, K., Balcerek, M. Review of second generation bioethanol production from residual biomass. Food Technology and Biotechnology. 56, 174-187 (2018).
- Cross, C. F., Bevan, E. J. Cellulose and chemical industry. Journal of the Society of Chemical Industry. 27, 1187-1193 (1908).
- Paloheimo, L., Eine, H., Kero, M. L. A method for cellulose determination. Agricultural and Food Science. 34, (1962).
- Kurschner, K., Hanak, A., Diese, Z. . Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung. 59, 448-485 (1930).
- Norman, A. G., Jenkins, S. A new method for the determination of cellulose, based upon observations on the removal of lignin and other encrusting materials. Biochemical Journalournal. 27, (1933).
- Kiesel, A., Semiganowsky, N. Cellulose-Bestimmung durch quantitative verzuckerung. Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft (A and B Series). 60, 333-338 (1927).
- Waksman, S. A. S., et al. A system of proximate chemical analysis of plant materials. Industrial Engineering Chemistry and Analytical Edition. 2, 167-173 (1930).
- Salo, M. -. L. Determination of carbohydrates in animal foods as seven fractions. Agricultural and Food Science. , 32-38 (1961).
- Giger-Reverdin, S. Review of the main methods of cell wall estimation: interest and limits for ruminants. Animal Feed Science and Technology. 55, 295-334 (1995).
- Updegraff, D. M. Semimicro determination of cellulose inbiological materials. Analytical Biochemistry. 32, 420-424 (1969).
- Viles, F. J., Silverman, L. Determination of starch and cellulose with anthrone. Analytical Chemistry. 21, 950-953 (1949).
- Scott, T. A., Melvin, E. H. Determination of dextran with anthrone. Analytical Chemistry. 25, 1656-1661 (1953).
- Kumar, M., Turner, S. Protocol: a medium-throughput method for determination of cellulose content from single stem pieces of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 11, 46 (2015).
- Yemm, E. W., Willis, A. J. The estimation of carbohydrates in plant extractsby anthrone. Biochemical Journal. 57, 508-514 (1954).
- Houston, K., Tucker, M. R., Chowdhury, J., Shirley, N., Little, A. The plant cell wall: A complex and dynamic structure as revealed by the responses of genes under Stress conditions. Frontiers in Plant Science. 7, (2016).
- Jiang, G., et al. Biomass extraction using non-chlorinated solvents for biocompatibility improvement of polyhydroxyalkanoates. Polymers. 10, 731 (2018).
- Li, T., et al. A saponification method for chlorophyll removal from microalgae biomass as oil feedstock. Marine Drugs. 14, 162 (2016).
- Wiltshire, K. H., Boersma, M., Möller, A., Buhtz, H. Extraction of pigments and fatty acids from the green alga Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae). Aquatic Ecology. 34, 119-126 (2000).
- Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. Comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part II: carbohydrates. Journal of Visualized Experiments. (1837), (2010).
- Haigler, C., Betancur, L., Stiff, M., Tuttle, J. Cotton fiber: a powerful single-cell model for cell wall and cellulose research. Frontiers in Plant Science. 3, (2012).
- Spirk, S., Nypelö, T., Kontturi, E. Editorial: Biopolymer thin films and coatings. Frontiers in Chemistry. 7, (2019).
- Long, L. -. Y., Weng, Y. -. X., Wang, Y. -. Z. Cellulose aerogels: Synthesis, applications, and prospects. Polymers. 10, 623 (2018).
