Estimativa do Teor de Celulose Cristalina de Biomassa Vegetal utilizando o Método Updegraff

A celulose é o componente primário de suporte de carga das paredes celulares, que está presente tanto nas paredes celulares primárias quanto secundárias. A parede celular é uma matriz extracelular que envolve células vegetais e é composta principalmente de celulose, lignina, hemicellulose, pectina e proteínas matriciais. Aproximadamente um terço da biomassa das plantas é a^{celulose 1} e desempenha papéis significativos no crescimento e desenvolvimento das plantas, fornecendo força, rigidez, taxa e direção do crescimento celular, manutenção da forma celular e proteção contra estressores bióticos e abióticos. A fibra de algodão contém 95% de teor de^{celulose 2,} enquanto as árvores contêm de 40% a 50% de celulose, dependendo das espécies vegetais e dos tipos de órgãos³. A celulose é composta por unidades repetitivas de celobiose, um disscarido de resíduos de glicose conectados por β-1,4 ligações glicossídicas⁴. O etanol celulósico é produzido a partir da glicose derivada da celulose presente nas paredes^{celulares da}planta 5 . A fibra celulósica é composta por várias micro fibrilas nas quais cada micro fibril atua como unidade central com 500-15000 monômeros de glicose^1,6. O homopolímero de celulose é sintetizado por complexos de sinthase de celulose incorporados de membrana plasmática (CSC’s)^1,7. Proteínas de celulose individual synthase A (CESA) sintetizam cadeias glucanas e as cadeias glucan adjacentes são conectadas por ligações de hidrogênio para formar celulose cristalina^1,8. A celulose existe em várias formas cristalinas com duas formas predominantes, celulose Iα e celulose Iβ como formas nativas⁹. Em plantas mais altas, a celulose existe na forma de celulose Iβ, enquanto a celulose vegetal inferior existe na forma Iα^10,11. No geral, a celulose desempenha um papel significativo na distribuição de força e rigidez para as paredes celulares da planta.

Os biocombustíveis de primeira geração são produzidos principalmente a partir de amido de milho, açúcares de cana e açúcares de beterraba, que são fontes de alimento, enquanto os biocombustíveis de segunda geração estão focando na produção de biocombustíveis a partir de material de parede celular de biomassa vegetal não-alimentar¹². A estimativa precisa do conteúdo de celulose cristalina não é apenas importante para pesquisas fundamentais sobre biosíntese de celulose e dinâmica da parede celular, mas também para pesquisa aplicada de biocombustíveis e produtos biológicos. Vários métodos foram desenvolvidos e otimizados para estimativa de celulose na biomassa vegetal, e o método Updegraff é o método mais utilizado para a estimativa de celulose. O primeiro método relatado para estimativa de celulose foi por Cross e Bevan em 1908¹³. O método baseou-se no princípio da cloração alternativa e extração por sulfato de sódio. No entanto, a celulose obtida pelos protocolos originais e modificados do método Cross e Bevan mostrou contaminação de pequenas frações de lignina, além de uma quantidade substancial de xilanas e mannans¹⁴. Apesar de várias modificações para remover lignina e hemicelluloses da fração de celulose, o método Cross-Bevan manteve uma quantidade considerável de mannans junto com celulose. Posteriormente, o método de Kurschner foi desenvolvido empregando ácido nítrico e etanol para extrair^{celulose 15}. Este método afirmava que o total de lignina e 75% dos pentosanos foram removidos, mas os resultados verdadeiros da celulose foram os mesmos estimados pelo método de cloração de Cross e Bevan. Outro método (Norman e Jenkins) foi desenvolvido empregando metanol-benzeno, sulfato de sódio e hipoclorito de sódio para extrair^{celulose 16}. Este método também reteve alguma fração de lignina (3%) e quantidades significativas de pentosanos levando a uma estimativa precisa da celulose. Mais tarde, Kiesel e Semiganowsky utilizaram uma abordagem diferente para hidrolisar a celulose usando ácido sulfúrico concentrado de 80%, e os açúcares reduzidos hidrolisados foram estimados pelo método de Bertrand¹⁷. Os dois métodos, Waksman e Stevens¹⁸ e Salo^14,19 que foram desenvolvidos com base no método de Kiesel e Semiganowsky, também renderam 4-5% menos teor de celulose em comparação com os métodos anteriores²⁰.

O método Updegraff é o método mais utilizado para a estimativa do teor de celulose cristalina. Este método foi descrito pela primeira vez pela Updegraff para a medição da celulose em 1969²¹. O método Updegraff integra o método Kurschner (uso de ácido nítrico), métodos Kiesel e Seminowsky (hidrólise da celulose em monômeros de glicose usando ácido sulfúrico) com algumas modificações, e o ensaio anthrone de Viles e Silverman para simples estimativa colorimétrica de glicose e teor de celulose cristalina²². O princípio deste método é o uso de ácido acético e ácido nítrico (reagente updeenxf) para eliminar hemicellulose e lignina dos tecidos vegetais homogeneizados, o que deixa celulose resistente a ácido acético/nítrico para posterior processamento e estimativa¹⁵. A celulose resistente a ácido actic/nítrico é tratada com ácido sulfúrico de 67% para quebrar a celulose em monômeros de glicose e os monômeros de glicose liberados são estimados pelo ensaio de anthrone^21,23. Várias modificações do método updegraff original foram utilizadas para simplificar o procedimento e a estimativa de celulose pelo ensaio de anthrone²⁴. Em linhas gerais, este método pode ser dividido em cinco fases. Na primeira fase, o material da planta é preparado. Na segunda fase, a parede celular bruta é separada da biomassa total, já que a celulose é o componente-chave das paredes celulares das plantas. Mais tarde, na terceira fase, a celulose é separada dos componentes da parede celular não celulósica, tratando com reagente Updegraff. Na quarta fase, a celulose resistente a ácido acético/nítrico é dividida em monômeros de glicose por tratamento de ácido sulfúrico. O tratamento de ácido sulfúrico da celulose resulta na formação de compostos 5-hidroximetilfurfurfural a partir da reação de monômeros de glicose com ácido sulfúrico. Finalmente, na última fase, o anthrone gera um complexo azul esverdeado fervendo com o composto furfural gerado na fase anterior²⁵. Este método colorimétrico baseado em anthrone foi usado pela primeira vez em 1942 por Dreywood. Anthrone é um corante que identifica compostos furfurais de pentose e hexose produtos desidratados como 5-hidroximetilfurfural, em condições ácidas. A reação com hexose produz uma cor intensa e melhor resposta em comparação com as pentoses²⁵. A quantidade de glicose encadernada é medida pela absorvância espectrofotômetro a 620 nm e a intensidade do complexo azul esverdeado é diretamente proporcional à quantidade de açúcar na amostra. Os valores medidos de absorvência foram comparados com uma linha de regressão padrão de glicose para calcular a concentração de glicose da amostra. O teor de glicose medido foi utilizado para estimar o teor de celulose da biomassa vegetal.