Zellfreie Produktion von Proteoliposomen für die funktionelle Analyse und Antikörperentwicklung gegen Membranproteine

Membranproteine sind eines der wichtigsten Wirkstoffziele in Diagnose und Therapie. Tatsächlich sind die Hälfte der kleinen Wirkstoffe Membranproteine wie G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) und Ionenkanäle¹. Im Laufe der Jahre haben Forscher an biochemischen, biophysikalischen und strukturellen Studien von Membranproteinen gearbeitet, um ihre Struktur und Funktion aufzuklären ^2,3. Die Entwicklung monoklonaler Antikörper gegen Membranproteine wird ebenfalls aktiv durchgeführt, um funktionelle und strukturelle Studien zu beschleunigen und therapeutische und diagnostische Anwendungen zu entwickeln 4,5,6,7,8,9. Alle diese Studien erfordern eine große Menge an hochwertigen Membranproteinen¹⁰. So werden beispielsweise mehrere Milligramm gereinigte Membranproteine mit natürlicher Konformation für die Antikörperentwicklung benötigt. Für die Röntgenkristallographie wird eine viel größere Menge an hochgereinigten Membranproteinen benötigt. Die Massenproduktion von Membranproteinen bleibt jedoch ein Engpass in der Membranproteinforschung¹¹. Membranproteine haben komplizierte Strukturen mit einer oder mehreren Transmembranhelices und spielen eine wichtige Rolle bei der Zellhomöostase. Die heterologe Überexpression von Membranproteinen führt zu mehreren Hindernissen wie der Aggregation von Membranproteinen, die sich in hohen lokalen Konzentrationen ansammeln, oder der Störung zellulärer Signalwege. Selbst wenn die Expression erfolgreich ist, stoßen auch nachfolgende Schritte der Probenvorbereitung auf Schwierigkeiten. Zum Beispiel erfordert die Herstellung von Proteoliposom hohe Fähigkeiten und Berufserfahrung in der Solubilisierung, Reinigung und Stabilisierung von Membranproteinen und kostet viel Aufwand und Zeit^12,13.

Auf der anderen Seite sind in den letzten Jahrzehnten einige fortschrittliche Technologien entstanden, um Proteine ohne die Verwendung lebender Zellen herzustellen 14,15,16,17,18. Die zellfreie Proteinsynthesetechnologie rekonstruiert die Translationsreaktion in einem Reagenzglas. Da es keine Einschränkungen gibt, die das zelluläre Expressionssystem hat, haben zellfreie Systeme das Potenzial, eine Vielzahl von Proteinen zu synthetisieren, die schwer zu exprimieren sind oder Toxizität in Zellen zeigen. Gereinigter Zellextrakt oder rekonstituierte translationale Maschinerie wird mit Template-mRNAs, Aminosäuren und Energiequellen gemischt, und rekombinante Proteine werden in kurzer Zeit synthetisiert. In Bezug auf die Membranproteinsynthese werden einige Arten von Gerüsten, die aus Lipiden oder Amphiphilen bestehen, wie Liposomen, Bizellen, Nanoscheiben oder Copolymere, zur zellfreien Reaktion 19,20,21,22,23,24 hinzugefügt. Synthetisierte Membranproteine interagieren mit den Gerüsten und können in Wasser stabilisiert werden. Zellfreie synthetisierte Membranproteine werden häufig in funktionellen Studien und der Antikörperproduktion verwendet 25,26,27,28,29,30,31.

In diesem Protokoll beschreiben wir eine effiziente zellfreie Methode der Proteoliposomenproduktion unter Verwendung eines weizenzellenfreien Systems und Liposomen. Weizenzellfreies Proteinsynthesesystem ist ein leistungsfähiges In-vitro-Translationssystem mit Extrakt aus Weizenkeimen 15,32,33. Weizenkeime enthalten eine große Menge an translationalen Maschinen und wenige Translationshemmer. Die translationale Maschinerie in Weizen, einem Mitglied der Eukaryoten, eignet sich für die Translation eukaryotischer Proteine, und seine Translationseffizienz wird durch die Codonverwendung der Template-mRNA kaum beeinflusst. Unter Verwendung des weizenzellfreien Systems haben wir eine Vielzahl von Proteinen synthetisiert, darunter Proteinkinasen^34,35, Ubiquitin-Ligasen^36, Transkriptionsfaktoren³⁷ und Membranproteine mit hohen Erfolgsraten. Für die Membranproteinproduktion fügen wir Lipidvesikelliposom als Gerüst^19,38 in die Translationsmischung ein. Hydrophobe Domänen des Membranproteins interagieren mit der Lipiddoppelschicht und sind spontan in das Liposom integriert. Die Dichtegradientenzentrifugation wird verwendet, um Proteoliposom von endogenen Weizenproteinen strikt zu trennen, obwohl eine gemeinsame Zentrifugation des Translationsreaktionsgemisches für eine einfache Reinigung von Proteoliposom²⁰ ausreicht. Viele Arten von integralen Membranproteinen wurden mit einem weizenzellenfreien System synthetisiert und für verschiedene Forschungen und Entwicklungen 25,38,39,40,41,42,43,44 angewendet. Darüber hinaus haben wir das “Bilayer-Dialyse-Verfahren” für die Großserienproduktion^45,46 entwickelt. Bei diesem Verfahren wird ein Becherdialysegerät in den Substratzufuhrpuffer eingetaucht, und es werden zwei Schichten Translationsreaktionsgemisch und Substratzuführpuffer im Becher gebildet, wie in Abbildung 1 gezeigt. Die kontinuierliche Zuführung von Substraten und die Entfernung des Nebenprodukts kann sowohl oben als auch unten des Reaktionsgemisches über einen langen Zeitraum effizient durchgeführt werden, was zu einer hervorragenden Translationseffizienz führt (Abbildung 2A und Abbildung 2B)⁴⁵.