JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Бесклеточная продукция протеолипосом для функционального анализа и разработки антител, нацеленных на мембранные белки

Published: September 22, 2020
doi:
10.3791/61871
,
1Graduate School of Medicine,Ehime University, 2Proteo-Science Center,Ehime University

Summary

Данный протокол описывает эффективный бесклеточный метод получения высококачественной протеолипосомы двухслойно-диализным методом с использованием бесклеточной системы пшеницы и липосом. Этот метод обеспечивает подходящие средства для функционального анализа мембранных белков, скрининга лекарственных мишеней и выработки антител.

Abstract

Мембранные белки играют важную роль в различных клеточных процессах и выполняют жизненно важные функции. Мембранные белки важны с медицинской точки зрения при открытии лекарств, потому что они являются мишенями более половины всех лекарств. Препятствием для проведения биохимических, биофизических и структурных исследований мембранных белков, а также развития антител была трудность в получении большого количества высококачественного мембранного белка с правильной конформацией и активностью. Здесь мы описываем «двухслойный метод диализа» с использованием системы без клеток зародышей пшеницы, липосом и диализных чашек для эффективного синтеза мембранных белков и получения очищенных протеолипосом за короткое время с высокой успешностью. Мембранные белки могут продуцироваться столько же, сколько в нескольких миллиграммах, таких как GPCR, ионные каналы, транспортеры и тетраспанины. Этот бесклеточный метод способствует сокращению времени, затрат и усилий на приготовление высококачественных протеолипосом и обеспечивает подходящие средства для функционального анализа мембранных белков, скрининга лекарственных мишеней и разработки антител.

Introduction

Мембранные белки являются одной из наиболее важных лекарственных мишеней в диагностике и терапии. Действительно, половина мелких составных лекарств-мишеней являются мембранными белками, такими как рецепторы, связанные с G-белком (GPCR) и ионные каналы1. На протяжении многих лет исследователи работали над биохимическими, биофизическими и структурными исследованиями мембранных белков, чтобы выяснить их структуру и функцию 2,3. Разработка моноклональных антител против мембранных белков также активно осуществляется с целью ускорения функциональных и структурных исследований и разработки лечебно-диагностических приложений 4,5,6,7,8,9. Все эти исследования требуют большого количества высококачественных мембранных белков10. Например, для выработки антител необходимо несколько миллиграммов очищенных мембранных белков с естественной конформацией. Для рентгеновской кристаллографии требуется гораздо большее количество высокоочищенных мембранных белков. Тем не менее, массовое производство мембранных белков остается узким местом в исследовании мембранных белков11. Мембранные белки имеют сложные структуры с одной или несколькими трансмембранными спиралями и играют важную роль в клеточном гомеостазе. Гетерологичная сверхэкспрессия мембранных белков приводит к множественным препятствиям, таким как агрегация мембранных белков, которые накапливаются при высоких локальных концентрациях или нарушении клеточных сигнальных путей. Даже если выражение лица будет успешным, последующие этапы пробоподготовки также столкнутся с трудностями. Например, приготовление протеолипосом требует высоких навыков и профессионального опыта в солюбилизации, очистке и стабилизации мембранных белков, а также требует больших усилий и времени, а также12,13.

С другой стороны, в последние десятилетия появились некоторые передовые технологии для производства белков без использования живых клеток 14,15,16,17,18. Технология бесклеточного синтеза белка воссоздает реакцию трансляции в пробирке. Поскольку нет никаких ограничений, которые имеет система клеточной экспрессии, бесклеточные системы имеют потенциал для синтеза различных белков, которые трудно экспрессировать или проявлять токсичность в клетках. Очищенный клеточный экстракт или восстановленный поступательный механизм смешивают с шаблонными мРНК, аминокислотами и источниками энергии, а рекомбинантные белки синтезируются за короткое время. Что касается синтеза мембранного белка, некоторые виды каркасов, состоящих из липидов или амфифилов, такие как липосомы, бицеллы, нанодиски или сополимеры, добавляются к бесклеточной реакции 19,20,21,22,23,24. Синтезированные мембранные белки взаимодействуют с каркасами и могут стабилизироваться в воде. Бесклеточные синтезированные мембранные белки широко используются в функциональных исследованиях и выработке антител 25,26,27,28,29,30,31.

В этом протоколе мы описываем эффективный бесклеточный метод получения протеолипосом с использованием бесклеточной системы пшеницы и липосом. Бесклеточная система синтеза белка пшеницы представляет собой мощную систему трансляции in vitro с использованием экстракта из зародышей пшеницы 15,32,33. Зародыши пшеницы содержат большое количество трансляционных механизмов и мало ингибиторов трансляции. Трансляционный механизм в пшенице, входящей в состав эукариот, подходит для трансляции эукариотических белков, и на его эффективность трансляции практически не влияет использование кодона шаблонной мРНК. Используя бесклеточную систему пшеницы, мы синтезировали различные белки, включая протеинкиназы34,35, убиквитиновые лигазы36, факторы транскрипции37 и мембранные белки с высокими показателями успеха. Для производства мембранного белка мы добавляем липидные везикулярные липосомы в трансляционную смесь в виде каркаса19,38. Гидрофобные домены мембранного белка взаимодействуют с липидным бислоем и спонтанно интегрируются с липосомами. Центрифугирование градиента плотности используется для строгого отделения протеолипосом от эндогенных белков пшеницы, хотя обычной центрифугации реакционной смеси трансляции достаточно для простой очистки протеолипосомы20. Многие виды интегральных мембранных белков были синтезированы с использованием бесклеточной системы пшеницы и применены для различных исследований и разработок 25,38,39,40,41,42,43,44. Кроме того, мы разработали «двухслойно-диализный метод» для крупносерийного производства45,46. В этом способе устройство для диализа чашечного типа погружают в буфер подачи субстрата, и в чашке образуются два слоя реакционной смеси трансляции и буфер подачи субстрата, как показано на рисунке 1. Непрерывная подача подложек и удаление побочного продукта могут эффективно проводиться как в верхней, так и в нижней части реакционной смеси в течение длительного времени, что приводит к превосходной эффективности трансляции (фиг.2А и фиг.2В)45.

Protocol

1. Получение плазмиды экспрессии pEU ПРИМЕЧАНИЕ: плазмида экспрессии pEU должна включать стартовый кодон, открытую рамку считывания белка целевой мембраны и стоп-кодон в фрагменте (см. Рисунок 1). При необходимости добавьте последовательность (последовательн?…

Representative Results

Используя этот протокол, частично очищенные протеолипосомы могут быть получены за короткое время. Репрезентативные результаты показаны на рисунке 2А. Двадцать пять GPCR классов A, B и C были успешно синтезированы с использованием метода двухслойного диализа (мелкомасштаб?…

Discussion

Представленный протокол обеспечивает способ получения мембранных белков с высокой успешностью. Этот протокол прост, хорошо воспроизводим и легко масштабируется. Он также имеет потенциал для сокращения времени и стоимости экспериментов, которые потребляют большое количество мембран…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано Проектом платформы для поддержки открытия лекарств и исследований в области наук о жизни (Основа для поддержки инновационных исследований в области лекарств и наук о жизни (BINDS)) от AMED под номером гранта JP20am0101077. Эта работа также была частично поддержана грантом JSPS KAKENHI No 20K05709.

Materials

×3 SDS-PAGE sample buffer Containing 10% 2-mercaptoethanol
5-20% gradient SDS-PAGE gel ATTO E-D520L
70% ethanol Diluted ethanol by ultrapure water.
Agarose Takara Bio
Ammonium acetate Nakalai tesque 02406-95 As this reagent is deliquescent, dissolve all of it in water once opened and store it at -30°C.
Ampicillin Sodium Nakalai tesque 02739-74
Asolectin Liposome, lyophilized CellFree Sciences CFS-PLE-ASL A vial contains 10 mg of lyophilized liposomes.
BSA standard 1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 µL ×1 SDS-PAGE sample buffer
CBB gel stain
cDNA clone of interest Plasmid harboring cDNA clone or synthetic DNA fragment
Chloroform Nakalai tesque 08402-84
Cooled incubator Temperature ranging from 0 to 40 °C or wider.
Creatine kinase Roche Diagnostics 04524977190
Dialysis cup (0.1 mL) Thermo Fisher Scientific 69570 Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.1 mL
Dialysis cup (2 mL) Thermo Fisher Scientific 88404 Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 2 mL
DNA ladder marker Thermo Fisher Scientific SM0311 GeneRuler 1 kb DNA Ladder
DpnI Thermo Fisher Scientific FD1703 FastDigest DpnI
E. coli strain JM109
Electrophoresis chamber ATTO
Ethanol (99.5%) Nakalai tesque 14713-95
Ethidium bromide
Evaporation flask, 100 mL
Gel imager
Gel scanner We use document scanner and LED immuninator as a substitute.
LB broth
Lipids of interest Avanti Polar Lipids
Micro centrifuge TOMY MX-307
NTP mix CellFree Sciences CFS-TSC-NTP Mixture of ATP, GTP, CTP, UTP, at 25 mM each
Nuclease-free 25 mL tube IWAKI 362-025-MYP
Nucrease-free plastic tubes Watson bio labs Do not autoclave. Use them separately from other experiments.
Nucrease-free tips Watson bio labs Do not autoclave. Use them separately from other experiments.
PBS buffer
PCR purification kit MACHEREY-NAGEL 740609 NucleoSpin Gel and PCR Clean-up
pEU-E01-MCS vector CellFree Sciences CFS-11
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) Nippon Gene 311-90151
Plasmid prep Midi kit MACHEREY-NAGEL 740410 NucleoBond Xtra Midi
Primer 1 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5’-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’
Gene specific primer, forward. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence.
Primer 2 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5'-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’
Gene specific primer, reverse. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence.
Primer 3 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5'-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3'
Forward primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.
Primer 4 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5'-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3'
Reverse primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.
Primer 5 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5’-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3’
Sequencing primer, forward
Primer 6 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5’- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3’
Sequencing primer, reverse
Protein size marker Bio-Rad 1610394 Precision Plus Protein Standard
Rotary evaporator
seamless cloning enzyme mixture New England BioLabs E2611L Gibson Assembly Master Mix
Other seamless cloning reagents are also avairable.
SP6 RNA Polymerase & RNase Inhibitor CellFree Sciences CFS-TSC-ENZ
Submarine Electrophoresis system
TAE buffer
Transcription Buffer LM CellFree Sciences CFS-TSC-5TB-LM
Translation buffer CellFree Sciences CFS-SUB-SGC SUB-AMIX SGC (×40) stock solution (S1, S2, S3, S4).
Prepare ×1 translation buffer before use by mixing stock S1, S2, S3, S4 stock and ultrapure water.
Ultrapure water We recommend to prepare ultrapure water by using ultrapure water production system every time you do experiment. Do not autoclave.
We preparaed ultrapure water by using Milli-Q Reference and Elix10 system.
Commercially available nuclease-free water (not DEPC-treated water) can be used as a substitute. Take care of contamination after open the bottle.
Ultrasonic homogenizer Branson SONIFIER model 450D-Advanced Ultrasonic cleaner can be used as a substitute.
UV transilluminator
Vacuum desiccator
Wheat germ extract CellFree Sciences CFS-WGE-7240 WEPRO7240
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
  2. Gusach, A., et al. Beyond structure: emerging approaches to study GPCR dynamics. Current Opinion in Structural Biology. 63, 18-25 (2020).
  3. Congreve, M., de Graaf, C., Swain, N. A., Tate, C. G. Impact of GPCR Structures on Drug Discovery. Cell. 181 (1), 81-91 (2020).
  4. Wilkinson, T. C. I. Discovery of functional monoclonal antibodies targeting G-protein-coupled receptors and ion channels. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 831-837 (2016).
  5. Hino, T., Iwata, S., Murata, T. Generation of functional antibodies for mammalian membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 23 (4), 563-568 (2013).
  6. Webb, D. R., Handel, T. M., Kretz-Rommel, A., Stevens, R. C. Opportunities for functional selectivity in GPCR antibodies. Biochemical Pharmacology. 85 (2), 147-152 (2013).
  7. Douthwaite, J. A., Finch, D. K., Mustelin, T., Wilkinson, T. C. I. Development of therapeutic antibodies to G-protein coupled receptors and ion channels: Opportunities, challenges and their therapeutic potential in respiratory diseases. Pharmacology and Therapeutics. 169, 113-123 (2016).
  8. Hashimoto, Y., Yagi, K., Kondoh, M. Current progress in a second-generation claudin binder, anti-claudin antibody, for clinical applications. Drug Discovery Today. 21 (10), 1711-1718 (2016).
  9. Hutchings, C. J., Colussi, P., Clark, T. G. Ion channels as therapeutic antibody targets. mAbs. 11 (2), 265-296 (2019).
  10. Errey, J. C., Fiez-Vandal, C. Production of membrane proteins in industry: The example of GPCRs. Protein Expression and Purification. 169, 105569 (2020).
  11. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  12. Wiseman, D. N., et al. Expression and purification of recombinant G protein-coupled receptors: a review. Protein Expression and Purification. 167, 105524 (2020).
  13. Jeffery, C. J. Expression, Solubilization, and Purification of Bacterial Membrane Proteins. Current Protocols in Protein Science. 83 (1), 1-15 (2016).
  14. Spirin, A. S., Baranov, V. I., Ryabova, L. A., Ovodov, S. Y., Alakhov, Y. B. A continuous cell-free translation system capable of producing polypeptides in high yield. Science. 242 (4882), 1162-1164 (1988).
  15. Takai, K., Sawasaki, T., Endo, Y. Practical cell-free protein synthesis system using purified wheat embryos. Nature Protocols. 5 (2), 227-238 (2010).
  16. Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).
  17. Shimizu, Y., Kuruma, Y., Ying, B. W., Umekage, S., Ueda, T. Cell-free translation systems for protein engineering. The FEBS Journal. 273 (18), 4133-4140 (2006).
  18. Klammt, C., et al. Cell-free expression as an emerging technique for the large scale production of integral membrane protein. The FEBS Journal. 273 (18), 4141-4153 (2006).
  19. Nozawa, A., et al. A cell-free translation and proteoliposome reconstitution system for functional analysis of plant solute transporters. Plant and Cell Physiology. 48 (12), 1815-1820 (2007).
  20. Nozawa, A., et al. Production and partial purification of membrane proteins using a liposome-supplemented wheat cell-free translation system. BMC Biotechnology. 11 (1), 35-45 (2011).
  21. Henrich, E., Hein, C., Dotsch, V., Bernhard, F. Membrane protein production in Escherichia coli cell-free lysates. FEBS Letters. 589 (15), 1713-1722 (2015).
  22. Henrich, E., Peetz, O., et al. Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology. eLife. 6, 243 (2017).
  23. Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins. Frontiers in Pharmacology. 10, 744 (2019).
  24. Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4031-4036 (2019).
  25. Sackin, H., Nanazashvili, M., Makino, S. I. Direct injection of cell-free Kir1.1 protein into Xenopus oocytes replicates single-channel currents derived from Kir1.1 mRNA. Channels. 9 (4), 196-199 (2015).
  26. Zemella, A., Richter, T., Thoring, L., Kubick, S. A combined cell-free protein synthesis and fluorescence-based approach to investigate GPCR binding properties. Methods in Molecular Biology. 1947 (10), 57-77 (2019).
  27. Vaish, A., Guo, S., Murray, R. M., Grandsard, P. J., Chen, Q. On-chip membrane protein cell-free expression enables development of a direct binding assay: A curious case of potassium channel KcsA-Kv1.3. Analytical Biochemistry. 556, 70-77 (2018).
  28. Suzuki, Y., et al. Functional G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) synthesis: the pharmacological analysis of Human Histamine H1 Receptor (HRH1) synthesized by a wheat germ cell-free protein synthesis system combined with asolectin glycerosomes. Frontiers in Pharmacology. 9, 38 (2018).
  29. Cortes, S., Barette, C., Beroud, R., De Waard, M., Schaack, B. Functional characterization of cell-free expressed Kv1.3 channel using a voltage-sensitive fluorescent dye. Protein Expression and Purification. 145, 94-99 (2018).
  30. Woznicka-Misaila, A., Juillan-Binard, C., Baud, D., Pebay-Peyroula, E., Ravaud, S. Cell-free production, purification and characterization of human mitochondrial ADP/ATP carriers. Protein Expression and Purification. 144, 46-54 (2018).
  31. Hashimoto, Y., et al. Engineered membrane protein antigens successfully induce antibodies against extracellular regions of claudin-5. Scientific Reports. 8 (1), 8383 (2018).
  32. Sawasaki, T., et al. A bilayer cell-free protein synthesis system for high-throughput screening of gene products. FEBS Letters. 514 (1), 102-105 (2002).
  33. Goshima, N., et al. Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome. Nature Methods. 5 (12), 1011-1017 (2008).
  34. Nemoto, K., Takemori, N., Seki, M., Shinozaki, K., Sawasaki, T. Members of the plant CRK superfamily are capable of trans- and autophosphorylation of tyrosine residues. The Journal of Biological Chemistry. 290 (27), 16665-16677 (2015).
  35. Takeda, H., et al. Comparative analysis of human src-family kinase substrate specificity in vitro. Journal of Proteome Research. 9 (11), 5982-5993 (2010).
  36. Takahashi, H., et al. Establishment of a wheat cell-free synthesized protein array containing 250 human and mouse E3 ubiquitin ligases to identify novel interaction between E3 ligases and substrate proteins. PLoS One. 11 (6), 0156718 (2016).
  37. Nozawa, A., et al. Construction of a protein library of Arabidopsis transcription factors using a wheat cell-free protein production system and its application for DNA binding analysis. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73 (7), 1661-1664 (2009).
  38. Goren, M. A., Nozawa, A., Makino, S. I., Wrobel, R. L., Fox, B. G. Cell-free translation of integral membrane proteins into unilamelar liposomes. Methods in Enzymology. 463, 647-673 (2009).
  39. Nozawa, A., et al. Production and partial purification of membrane proteins using a liposome-supplemented wheat cell-free translation system. BMC Biotechnology. 11 (1), 35 (2011).
  40. Renauld, S., et al. Functional reconstitution of cell-free synthesized purified Kv channels. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1859 (12), 2373-2380 (2017).
  41. Liu, S., et al. Efficiency and Safety of CRAC Inhibitors in Human Rheumatoid Arthritis Xenograft Models. Journal of Immunology. 199 (5), 1584-1595 (2017).
  42. Jarecki, B. W., Makino, S. I., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. Function of shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into xenopus oocytes. Scientific Reports. 3, 1-7 (2013).
  43. David, G., et al. Phosphorylation and alternative translation on wheat germ cell-free protein synthesis of the DHBV large envelope protein. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 138 (2019).
  44. Jirasko, V., et al. Proton-detected solid-state NMR of the cell-free synthesized α-helical transmembrane protein NS4B from hepatitis C virus. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 21 (10), 1453-1460 (2020).
  45. Takeda, H., et al. Production of monoclonal antibodies against GPCR using cell-free synthesized GPCR antigen and biotinylated liposome-based interaction assay. Scientific Reports. 5, 11333 (2015).
  46. Zhou, W., Takeda, H. Production of immunizing antigen proteoliposome using cell-free protein synthesis system. Methods in Molecular Biology. 1868, 49-67 (2018).
  47. Hutchings, C. J., Koglin, M., Marshall, F. H. Therapeutic antibodies directed at G protein-coupled receptors. mAbs. 2 (6), 594-606 (2010).
  48. Raetz, C. R. H., et al. Discovery of new biosynthetic pathways: the lipid A story. Journal of Lipid Research. 50, 103-108 (2009).
  49. Baldridge, J. R., Crane, R. T. Monophosphoryl lipid A (MPL) formulations for the next generation of vaccines. Methods. 19 (1), 103-107 (1999).

Tags

Cell-free ProductionProteoliposomesMembrane ProteinsDrug DiscoveryIn-vitro Protein SynthesisLiposome PreparationWheat Germ ExtractTranscriptionTranslationCell-free Expression

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Zhou, W., Takeda, H. Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (163), e61871, doi:10.3791/61871 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image