JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Автоматизированный анализ походки для оценки функционального восстановления у грызунов с периферической нервной или спинного мозга ушиб травмы

Published: October 06, 2020
doi:
10.3791/61852
, , , , , ,
1Department of Hand-, Plastic, Reconstructive and Burn Surgery, BG Trauma Center Tubingen,Eberhard Karls University, 2Ludwig Boltzmann Institute for Experimental and Clinical Traumatology, 3Austrian Cluster for Tissue Regeneration

Summary

Автоматизированный анализ походки является возможным инструментом для оценки функционального восстановления в моделях грызунов периферической травмы нерва и ушиба спинного мозга. Хотя для оценки функции локомотива в различных экспериментальных моделях требуется только одна установка, очень важна тщательная регулировка твердой и мягкой посуды и обучение животных.

Abstract

Травмы периферических и центральных нервов в основном изучаются у грызунов, особенно крыс, учитывая тот факт, что эти модели животных являются экономически эффективными и много сравнительных данных было опубликовано в литературе. Это включает в себя множество методов оценки для изучения функционального восстановления после травмы нерва и ремонта. Помимо оценки регенерации нервов с помощью гистологии, электрофизиологии и других методов оценки in vivo и in vitro, функциональное восстановление является наиболее важным критерием для определения степени нейронной регенерации. Автоматизированный анализ походки позволяет записывать огромное количество параметров, связанных с походкой, таких как Paw Print Area и Paw Swing Speed, а также измерения межвимберной координации. Кроме того, метод предоставляет цифровые данные о лапах крыс после повреждения нейронов и во время регенерации нервов, добавляя к нашему пониманию того, как периферические и центральные нервные травмы влияют на их локомотивное поведение. Помимо преимущественно используемой модели травмы седалищного нерва, с помощью этого метода можно изучать другие модели повреждения периферического нерва, такие как бедренной нерв. Помимо травм периферической нервной системы, можно оценить поражения центральной нервной системы, например, ушиб спинного мозга. Действительная и воспроизводимая оценка данных в значительной степени зависит от тщательной корректировки жестких и программных настроек до получения данных. Кроме того, решающее значение имеет надлежащее обучение экспериментальных животных. Эта работа призвана проиллюстрировать использование компьютеризированного автоматизированного анализа походки для оценки функционального восстановления в различных животных моделях повреждения периферического нерва, а также ушиба спинного мозга. Он также подчеркивает ограничения метода, например, оценка регенерации нервов у крыс с седалищным нервом neurotmesis из-за ограниченного функционального восстановления. Таким образом, этот протокол, как полагают, чтобы помочь исследователям, заинтересованным в периферических и центральных нервных травм для оценки функционального восстановления в моделях грызунов.

Introduction

Травмы периферической и центральной нервной системы часто изучаются у грызунов, в результате чего большое количество сравнительных данных о ходе повреждения нерва, ремонт, или нейропротекторной для противодействия дальнейшей вторичнойтравмы и регенерации 1,2,3. Результаты экспериментальных стратегий лечения в моделях грызунов могут быть оценены с помощью различных методов, таких как гистология, иммуногистохимия, электрофизиология и методы визуализации, такие как рентгеновская микротомография (КТ) сканирование, но наиболее важным критерием для определения успеха лечения является, как у пациентов с человеком–степень функционального восстановления 4,5. Первые исследования, исследуя производительность локомотивов у грызунов восходят к 1940-хгодов 6,7,8. Крысы и мыши были предметом большого количества исследований, исследуя их поведение локомотивов впоследующие десятилетия 9,10,11. В настоящее время существует широкий спектр методов оценки моделей грызунов периферических и центральных нервных травм, начиная от анализа пешеходнойдорожки с чернилами и бумагой 12,13,14 надлодыжкой и походкой кинематики 15,16,17 до машинного обучения расширенные методы, которые позволяют для комплексной оценки походки, конечности и совместныхтраекторий 18,19.

Компьютеризированный автоматизированный анализ походки (AGA) используется для оценки функции локомотива после периферических и центральных нервных травм и потенциального экспериментального лечения таких травм. Устройство в основном состоит из стеклянной дорожки и источника света, который освещает отпечатки лап грызунов в корреляции с давлением, превышенное ими. Затем эти данные компьютеризируются для расчета широкого спектра статических и динамических параметров. Согласно Deumens, эти параметры могут быть дополнительно разделены на категории общих параметров, связанных с болью параметров, а также связанных скоординацией параметров походки 20(таблица 1). Осуществимость AGA для обнаружения изменений в поведении походки было доказано в различных животных моделей повреждения периферического нерва (PNI)21, таких какседалищный нерв 20,бедренной нерв 22, исредний нерв 23,24. Он также регулярно используется для оценки функции локомотива у крыс с центральными нервными травмами, например,инсульт 25 или ушиб спинного мозга26. Достижения метода лежат в большом количестве сопоставимых данных и его возможности записывать множество параметров, связанных с походкой27. Данная работа призвана предоставить исследователям, заинтересованным в животных моделях PNI и травмы спинного мозга (SCI) с подробным и практическим руководством для оценки функции локомотива в таких моделях.

Категории Параметр Описание
Общие параметры походки Область печати (единица расстояния) Область отпечатка лапы
Длина печати (единица расстояния) Длина отпечатка лапы
База поддержки (BoS) (единица расстояния) Расстояние между двумя задними или передними лапами
Длина шага (единица расстояния) Расстояние между двумя последовательными размещениями лапы
Параметры походки, связанные с болью Время качели (ы) Продолжительность фазы качели
Время стенда (ы) Продолжительность фазы позиции
Средняя интенсивность печати лап (произвольное подразделение) Средняя iIntensity печати лапы во время фазы позиции
Параметры походки, связанные с координацией Нормальные шаблоны последовательности шагов (NSSP) Конкретные последовательности размещения лап во время цикла шага
Фазовая дисперсия (%) Временные различия между шагами двух конкретных лап
Индекс регулярности (RI) (%) Количественная оценка межлимбной координации путем деления количества безупречных времени NSSP 4 на общее количество размещения лап в течение одного цикла шага

Таблица 1: Параметры походки, оцениваемые с помощью автоматизированного анализа походки. Категории, в которых классифицируются параметры, выбираются в соответствии с Deumens et al.20.

Protocol

Экспериментальный протокол для всех экспериментов был предварительно утвержден Советом по обзору протоколов животных при правительстве города Вены. Все процедуры были проведены в полном соответствии с Хельсинкской декларацией о правах животных и Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения. 1. Корпус для животных Дом самцов крыс (Льюис или Спраг Доули) весом 250-300 г под 12 ч свет / темный цикл с объявлением libitum доступ к пище и воде. Контроли как комнатной температуры (поддерживается при температуре 20-22 градусов по Цельсию), так и влажности (45%-65%) для надлежащего жилья для животных. Для этой работы, мужчины Льюис (PNIs) и Спраг Доули (SCI) крысы были использованы. Предоставьте новую, очищенную клетку два раза в неделю. Дом крыс в группах по два или три и внимательно следить за их социальным поведением и взаимодействием. Разрешить крыс акклиматизации период, по крайней мере за 1 неделю до любой хирургической процедуры или функционального тестирования.ПРИМЕЧАНИЕ: Крысы требуют по крайней мере 5 дней ежедневных тренировок на аппарате анализа походки до операции, так что рассчитать по крайней мере 2 недели между прибытием крыс на объекте и запланированные данные для экспериментальнойхирургии 28. 2. Индукция травмы нерва ПРИМЕЧАНИЕ: Носите средства индивидуальной защиты, такие как хирургическое платье, перчатки и маску. В случае, если стерильные хирургические платья не доступны, чистый, отмытый лабораторный слой также достаточно. Если он не становится загрязненным, платье или пальто не должны быть изменены между животными, но между сессиями хирургии. Рекомендуется использовать стерильные хирургические перчатки. В случае, если такие перчатки не доступны, осмотр перчатки также могут быть использованы, но должны быть вымыты до операции с помощью хирургического дезинфицирующего средства. Перчатки должны быть изменены между животными. В день операции старайтесь минимизировать любое количество стресса для животных, так как это может помешать анестезии, например, животные потребуют более высоких доз анестезии. В день операции, вводить 0,05 мг Бупренорфин /кг массы тела в суспензии с 100-200 йл 0,9% NaCl подкожно с помощью 25 G канула 1 ч до операции, чтобы обеспечить предоперационной анальгезии. Если не указано иное, фланг крысы является предпочтительным местом для инъекций. Анестезировать крыс, поместив их в анестезии индукционной камеры подключены к севофлюран испаритель и активный контейнер мела для поглощения CO2. Обезболить крысу, затопив анестезию окно с 4%-5% севофлюран-кислородной смеси в течение 5 мин с использованием кислородного потока 1,5 л / мин (фаза инициации). Подключите пульс оксиметрии клип на одну из лап для мониторинга насыщения крови грызунов кислорода. Поддержание состояния общей анестезии с 2,5%-4,5% севофлюран-кислородной смеси.ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментальной хирургии, общая анестезия является обязательным. Подтвердите общую анестезию, проверяя отсутствие реакции на щепотку стимула хвоста или лап. Когда крыса вошла в общую анестезию, брить соответствующие areal, что будет работать на и дезинфицировать область, проводя его чередуя с алкоголем и дезинфицирующим средством для кожи. Окончательный салфетки должны быть выполнены с дезинфицирующим средством для кожи. Поместите его на регулируемый грелку в необходимом положении (на спине для модели бедренной нерва, склонной к седалищной и SCI модели). Вставьте гибкий зонд термометра в прямую кишку крысы, чтобы контролировать температуру животного и поддерживать его на уровне около 37 градусов по Цельсию во время операции. Во время анестезии защитите глаза крысы от высыхания с помощью глазной мази 3. Хирургическая индукция травмы нерва При выполнении хирургических процедур строго придерживайтесь семи принципов Halsted29 следующим образом: Всегда обрабатывайте ткани мягко при работе с ними. Избегайте разрыва или дробления тканей.ПРИМЕЧАНИЕ: Самодельные30 или коммерчески доступные системы втягивателя полезны, чтобы держать мышцы и сосуды из операционной области. Тщательно поддерживать гемостаз с помощью электрического гемостата для прижигания сосудов или лигатур, чтобы гарантировать тщательный гемостаз. Всегда поддерживайте кровоснабжение тканей, тщательно рассекая их и деликатно обнося с ними. Поддерживайте строгий асепсис, надев маску, платье и стерильные перчатки. Избегайте напряжения на тканях, применяя швы, которые не являются ни слишком туго, ни слишком свободно. Тщательно appose тканей, в результате чего их соответствующие края вместе без каких-либо перекрывающихся.ПРИМЕЧАНИЕ: Это особенно важно в случае эпиневральной или промежной нейроррхафии. Выполняйте все микрохирургические процедуры под увеличением в 6х16 раз с помощью операционного микроскопа. В идеале, микроскоп обеспечивает две пары глаз, чтобы обеспечить наблюдение за операцией помощником. Избегайте создания мертвых пространств, тщательно завявая различные слои тканей. Индукция седалищного нерва neurotmesis правого hindlimb Выставить право седалищного нерва на уровне среднего уровня, выполняя 5 см длиной разрез на спинной стороне задней конечности с #10 скальпель лезвие подключено к #3 скальпель ручкой и путем вскрытия чрезмерно мускулатуры и мягких тканей. Поместите ретрактор внутри раны, чтобы сохранить вскрытую мускулатуру и кожу из ситуса. Аккуратно разоблачить нерв, удалив окружающие ткани с помощью изогнутых микрохирургических ножниц. Удалите 8 мм длинный нервный сегмент седалищного нерва 1-2 мм проксимальной его трифуркации с прямыми микрохирургическими ножницами. Поверните нервный сегмент на 180 градусов, поместите его между проксимальным и дистальным пнем трансектного седалищного нерва и выполните эпиневрологическую нейрорафию на каждом участке с двумя прерванными 10-0 швами и микрохирургическим держателем иглы. Индукция бедренной нервной нейротмезис на правой задней части Выполните продольный разрез паха 3-4 см с #10 скальпелем, подключенным к #3 скальпелу, чтобы разоблачить правый бедренной нервно-сосудистый пучок. Используйте хирургические ножницы для тупого вскрытия до бифуркации бедренной нерва подвергается. Поместите ретрактор внутри раны, чтобы сохранить вскрытую мускулатуру и кожу из ситуса. Трансект открытых двигательных и сенсорных ветвей дистальной бифуркации и акциз 6 мм длиной нервного сегмента каждой ветви, соответственно, с помощью прямых микрохирургических ножниц. Поверните оба нервных сегмента на 180 градусов, поместите их между проксимальным и дистальным пнем транскретных ветвей бедренной нерва и выполните эпиневрическую нейрореафию на каждом участке с двумя прерванными швами 11-0 и микрохирургическим держателем иглы.ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните гомотопический аутологичный трансплантат нерва путем прививки моторного трансплантата к первоначальной моторной ветви и сенсорного трансплантата к первоначальной сенсорной ветви. Кроме того, выполнить гетеротопный аутологичный трансплантат нерва путем прививки двигательного трансплантата в оригинальной сенсорной ветви и наоборот. Индукция ушиба грудного спинного мозга Выполните разрез кожи через грудной позвоночник с лезвием скальпеля #10, подключенным к #3 скальпелу, за которым следуют два мышечных разреза параллельно спинным процессам для облегчения опрокидывания мышц. Поместите ретрактор внутри раны, чтобы сохранить вскрытую мускулатуру и кожу из ситуса. Определите 11-й грудной позвонок (Th) и разоблачить ламина позвоночной арки путем удаления чрезмерной ткани, а также спинной процесс с помощью rongeur. Выполните ламинэктомию с помощью микросверла и соответствующего заусенца, чтобы просверлить небольшое отверстие в ламине, немного больше, чем кончик ударора. Чтобы предотвратить повреждение спинного мозга, только тонкие из ламины при открытии и увеличении отверстия с помощью rongeur. Если periosteum все еще не поврежден, тщательно удалите его с помощью резкого остроконечного зонда, не повреждая dura mater. После обеспечения достаточно большой отверстие сделано без дестабилизации ламины, держать позвоночник животного на месте, зажимая его rostrally и caudally к Th11 с стабилизирующими типсами ударного. Используя ручные колеса спереди и сбоку, распойте стальной стержень на 3-5 мм выше отверстия для ламинэктомии. Наконец, подвергать всех животных воздействию с определенной силой 150 килодин, чтобы вызвать легкой до умеренной степени ушиба спинного мозгатравмы 4. Выполните замыкание раны в анатомических слоях с помощью полиглактина 4-0 или 5-0 прерванных швов и хирургического держателя иглы. Тщательно очистите рану, аккуратно вытирая ее марлевой площадкой, пропитанной стерильной 0,9% NaCl. После операции верните животных в домашнюю клетку и укройте их от воздействия света и звука. Внимательно следите за поведением животных до послеоперационного дня (DPO) 7 и обеспечивает достаточное потребление пищи и воды. При необходимости обеспечьте дополнительную жидкость при подкожных инъекциях (например, 10 мл NaCl 0,9%). Обеспечить послеоперационную анальгезию в течение как минимум 2 дней с помощью, например, опиоидов (0,05 мг/кг массы тела бупренорфина подкожно (с.c.)) и/или жаропонижания (4 мг/кг массы тела carprofen s.c.). При необходимости, а также в случае модели SCI, также обеспечить послеоперационную антибиотикотерапию (7,5 мг/кг веса тела Энрофлоксацин на ос (p.o.)). В случае повреждения спинного мозга, вручную опорожнить мочевой пузырь крысы до спонтанного мочеиспускания возвращается. 4. Восстановление после хирургических вмешательств до анализа походки ПРИМЕЧАНИЕ: Крысы с травмой седалищного нерва показывают тенденцию грызть задние лапы из-за наступления болезненной невропатии после травмы нерва. Эта форма автомутации может привести к автоампутации ног или частей соответствующей задней лапы. Предпочитают Льюис крыс помимо других штаммов крыс в случае при использовании модели травмы седалищного нерва, так как этот штамм крыс показывает меньшую тенденцию дляавтомутиляции 31. Крысы с седалищной травмой нерва также показывают тенденцию к разработке контрактуры оперировать конечности, что может привести к их исключению из исследования из-за вмешательства в сбор данных. Такие неблагоприятные явления происходят гораздо реже у крыс с бедренной травмой. Осмотр животных ежедневно после операции с особым вниманием к состоянию их конечностей и лап, соответственно.ПРИМЕЧАНИЕ: У крыс с SCI, на высоте Th11, полового члена или ректальной пролапс может произойти из-за нарушения естественной способности животных мочиться и испражняться. Эти события обычно определяются как конечные точки исследования человека и подразумевают немедленное исключение пострадавшего животного из исследования. Продолжайте послеоперационную анальгезию до тех пор, пока крысы не перестанут показывать какие-либо болевые симптомы. В случае постоянной боли, управлять габапентин (30-120 мг/кг массы тела) р.о. для лечения невропатической боли. 5. Подготовка до проведения автоматизированного анализа походки ПРИМЕЧАНИЕ: Методология системы анализа походки основана на записи животных снизу при пересечении стеклянной пластины, которая освещается зеленым светодиодным светом. Когда лапы животных со контактом с полом, область лапы печати освещается и записывается высокоскоростной видеокамерой. Эти данные затем отправляются через кабель Ethernet на компьютер под управлением программного обеспечения анализа походки. В то время как отдельные следы могут быть классифицированы вручную экспериментатором, последняя версия программного обеспечения также имеет автоматическую классификацию следа. Выполняем все процедуры тестирования в темноте и при отсутствии тревожных звуков. Так как крысы способны воспринимать сверхзвуковые частоты, также убедитесь, что никакие источники не излучают такие звуки.ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните анализ походки либо еженедельно или каждые две недели, но не тест крыс слишком часто, как особенно Льюис крысы, как правило, теряют интерес к участию в процедуре с течением времени, когда они подвергаются определенным упражнения слишком часто. Это, однако, необходимо тренировать крыс ежедневно в течение 5 дней до операции, чтобы акклиматизировать их к среде тестирования и процедуры. Во время тренировок и в день тестирования подготовьте поведенческий испытательный зал, отключив все источники света, которые в противном случае могли бы помешать камере автоматизированного анализа походки. Поместите экран компьютера, необходимый для получения данных от камеры, чтобы предотвратить его свет от вмешательства в камеру. Убедитесь, что устройство установлено в стабильном положении и таким образом, чтобы не мешать любой форме вибрации, так как это серьезно помешает процедуре сбора данных. Принесите крыс в поведенческий испытательный зал и акклиматизировать их в своей собственной клетке дома, по крайней мере 30 минут до теста.ПРИМЕЧАНИЕ: Всякий раз, когда обработка животных, носить средства индивидуальной защиты, такие как хирургическое платье или лабораторное пальто, перчатки и маску. 6. Выполнение автоматизированного анализа походки ТренировкиПРИМЕЧАНИЕ: Во время обучения, животные будут проходить кривой обучения, поэтому рекомендуется корректировать график обучения постепенно. Используйте пищевые награды (например, 1-2 куска хлопьев для завтрака), чтобы вознаградить животных после успешного завершения каждой тренировки. В первый день тренировки аккуратно поднимите животное, удерживая его под стволом, и аккуратно отвейте его к входу в дорожку. Поместите животное в зону входа и дайте ему исследовать открытие коридора без какого-либо вмешательства со стороны лица, проводя процедуры тестирования.ПРИМЕЧАНИЕ: Не кричать, свистеть, дуть или тыкать животное в попытке мотивировать его пересечь дорожку. Все такое поведение сильно подожнит животное и еще больше усложнит процедуру сбора данных. Подождите, пока животное добровольно пересекает дорожку, чтобы добраться до своей домашней клетки. Иногда, особенно у неподготовленных животных, это может занять до нескольких минут. В первый тренировочный день животное не ожидается и не обязано делать непрерывные пробежки с равномерной скоростью ходьбы. Вместо этого он должен акклиматизироваться с испытательным аппаратом и процедурой. На второй день тренировки приучаем животных без колебаний выходить на дорожку, а также без колебаний возвращаться в свою домашнюю клетку. Некоторые животные, вероятно, уже научились пересекать дорожку без перерывов, но это все еще не требуется в конце второго дня. На третий день обучения, обеспечить животных научиться пересекать дорожку без колебаний, нюхать, или иным образом исследовательских движений. Убедитесь, что они ходят с равномерной скоростью. На четвертый и пятый день обучения повторите предыдущее упражнение для закрепления процедуры тестирования.ПРИМЕЧАНИЕ: В случае, если животное не приобретает необходимых навыков, чтобы пересечь дорожку должным образом к концу 5-дневного периода обучения, добавить 2 дополнительных дня обучения (например, в выходные дни). Кроме того, рассмотреть вопрос о выполнении до 3 учебных занятий в день, разделенных по крайней мере 2 ч отдыха между индивидуальной сессии. В 95% случаев животное приобретет необходимый опыт обучения к концу этого длительного периода обучения. В редких случаях животное до сих пор не приобрело этот навык после 7 дней тренировок, рекомендуется отложить запланированную экспериментальную операцию как минимум на 1 неделю и повторить вышеупомянутый тренировочный режим. 7. Сбор данных ПРИМЕЧАНИЕ: Система анализа походки визуализирует каждую лапу печати в то время как животное идет и автоматически анализирует различные параметры походки, такие как Paw Print Area, Paw Print Интенсивность, Paw Swing Time, и Paw Swing Speed (Таблица 1). Поскольку система анализа походки записывает все данные, основанные на интенсивности отпечатков лап животных, убедитесь, что настройки камеры корректируются в зависимости от веса и размера крыс. Кроме того, убедитесь, что дорожка сухая и чистая перед записью данных, чтобы предотвратить какое-либо влияние на получение данных. Перед приобретением каких-либо данных, очистить дорожку с помощью коммерческих стеклоочистить и squeegee. Спрей стеклянной пластины несколько раз, а затем протрите его squeegee удалить любые частицы с его поверхности. Кроме того, очистить под. Убедитесь в том, чтобы удалить любую жидкость с концов дорожки, так как животные могли бы в противном случае наступить на него, что повлияет на записанные данные. Повторите процедуру очистки, когда это необходимо, например, загрязнение дорожки и перед записью данных крысы из другой клетки. Считается, что это, чтобы предотвратить животное от отвлекаться на запах их conspecifics. Перед самым первым сбором данных отрегулируйте настройки камеры, подходящие для веса животных. Подтвердите это, поставив самое легкое и тяжелое животное на дорожке и выберите настройки камеры, которая позволяет хорошее качество данных в обоих случаях. Отрегулируйте усиление камеры, красный потолок света, зеленый свет дорожки, и зеленый порог интенсивности (GIT) для обеспечения оптимального обнаружения отпечатков лап.ПРИМЕЧАНИЕ: Не меняйте выбранные настройки после начала сбора данных, так как это будет препятствовать сопоставимости полученных данных. В качестве исключения GIT может быть изменен во время классификации данных, но это должно быть сделано для всех испытаний равномерно. Определите и откалибруйте дорожку с помощью предоставленного листа калибровки. Выберите зарегистрированную камеру, указанную во вкладке Настройка. Нажмите на кнопку «Открытое приобретение», которую можно найти во вкладке «Приобретение». Сделайте снимок пустой, очищенной дорожки, которая будет использоваться в качестве эталона на протяжении всей следующей процедуры сбора данных. Обратите внимание, что статус меняется от ожидания снимка к готовым к приобретению. Нажмите на кнопку «Начало приобретения» и обратите внимание на изменение статуса с «Готов к приобретению» до «Ожидание запуска». Поместите крысу на дорожку и следуйте за движением животного на экране компьютера. Обратите внимание на изменение статуса от ожидания запуска до начала записи Run.ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение будет автоматически классифицировать работает он считает совместимым в соответствии с заданными характеристиками запуска с зеленым символом, в то время как несовместимые работает будет отмечен красным символом. Программное обеспечение автоматически останавливает сбор данных при записи трех совместимых запусков, но сбор данных может быть продолжен, нажав на кнопку Start Acquisition снова. 8. Классификация данных ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к таблице 1 для списка параметров результатов AGA. По крайней мере, три совместимых работает необходимы, в которых животное должно пересечь дорожку постоянно без колебаний27. Кроме того, скорость бега должна соответствовать тем же категориям, что и в литературе30. Нажмите на кнопку Классификация во вкладке Экспериментальный исследователь соответствующих испытаний, которые должны быть классифицированы. Воспроизведение приобретенного запуска с нормальной скоростью, чтобы получить представление о том, соответствуют ли данные перечисленным ранее требованиям. В левом-верхнем углу нажмите кнопку Auto Classify для автоматической классификации отпечатков лап программным обеспечением.ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя программное обеспечение имеет высокий уровень правильной классификации лап, иногда не может назначить лапу отпечатков или назначает неправильную лапу. Поэтому всегда дважды проверяйте автоматически классифицированные отпечатки лап впоследствии. Для правильного расчета шаблонов последовательности нормальных шагов (NSSP) убедитесь, что алгоритм классификации не смущает не видимые отпечатки лап, что приводит к недостатку NSSP(рисунок 1A). Таким образом, включают только отпечатки лап, которые обнаруживаются в то время как контралатеральная лапа также видна для расчетов NSSP, например, левая передняя лапа (LF) и правая задняя лапа (RH) (Рисунок 1B). Рисунок 1: Примерные данные АГА, демонстрирующие необходимость ручной двойной проверки правильной классификации данных. В случае, если обнаруженное размещение передней лапы сменяется обнаруженным размещением другой переднейлапы (A) программное обеспечение AGA может спутать это с нескоординированной моделью ходьбы, так как задние лапы не были обнаружены. Поэтому рекомендуется всегда дважды проверять и выбирать начальный отпечаток лапы, который обнаруживается, когда также видна контралатеральная лапа(В). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. 9. Расчет статистики ПРИМЕЧАНИЕ: Для корректировки данных о пробеге для увеличения веса, связанных с изменениями с течением времени, настоятельно рекомендуется рассчитать соотношение экспериментальной лапы с неиспециалийной (например, контрольной) лапой. Кроме того, рассчитать соотношение к предоперационных значений этой лапы к лапе сравнения для рассмотрения индивидуальных различий в использовании лап. Нажмите на кнопку «Статистика просмотров», чтобы получить полный обзор статистики бега. Выберите файл и экспорт для статистики запуска экспорта или пробной статистики в программное обеспечение электронной таблицы.

Representative Results

12 крыс прошли экспериментальную периферическую операцию на нерве. Седалищная нервная ресекция(рисунок 2A) была выполнена у 7 крыс, в то время как бедренная нервная нейротмезиса(рисунок 2B) была вызвана у 5 крыс. У всех животных нервный дефект реконструировался с помощью аутологичного трансплантата нерва. Ушиб ушиба спинного мозга(рисунок 2C) на уровне Th11 был вызван в 6 крыс, в результате чего в общей сложности 18 крыс. Рисунок 2: Оперативные сайты после реконструкции нерва. Реконструкция нерва с аутотрансплантатами в седалищномнерве (A)и бедренной нерве(B),а также после ушиба ушиба спинного мозга(C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Все животные хорошо оправились от операции, и никаких случаев нанесения себе увечий не было. Одно животное группы травм седалищного нерва разработало сильные контрактуры правой задней лапы в течение послеоперационного периода наблюдения и должно было быть исключено из дальнейшего анализа данных. Скиатический нерв нейротмезисТак как седалищный нерв обеспечивает мышечную и сенсорную иннервацию большинству задних конечностей, его ресекция приводит к серьезному нарушению функции локомотива. После травмы, крысы используют пятки лапы для поддержки веса только (Рисунок 3B-E) и конечности перемещается в радикальных обходных движения. Таким образом, локомотивные изменения, оцениваемые с помощью AGA, становятся очевидными с помощью значительно уменьшеннойобласти печати (рисунок 4A)и значительно увеличенного времени качели(рисунок 4B). Оба параметра были по-прежнему существенно изменены по сравнению с измерениями, проведенными до ОП по окончании периода наблюдения. Примечательно, что одно животное разработало сильные контрактуры правой задней лапы, начиная с послеоперационной недели (WPO) 10. Это привело к увеличению площади печати правой задней лапы до более чем 150% по сравнению с левой лапой на WPO12 (Рисунок 5). Поскольку это был экстрем по сравнению со всеми другими животными, оцененными в этом исследовании, мы исключили это животное из анализа данных в отношении печатной области. Рисунок 3: Представитель лапы печатает до и после критического размера resection правого седалищного нерва и автотрансплантата ремонта. Обратите внимание на сильное снижение площади печати после повреждения нерва (B) по сравнению с предоперационной(A). Несмотря на небольшое увеличение в области печати в течение периода наблюдения (C-E) отпечатки лап правой задней конечности остались заметно изменены от базовых записей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 4: Курс функционального восстановления после ресекции критических размеров и аутотрансплантатного ремонта седалищного нерва. Коэффициент площади печати(A) и коэффициент времени качания(B) были статистически изменены значительно от значений Pre-OP сразу после седалищного нерва resection. В то время как площадь печати оставалась значительно уменьшенной по сравнению с базовым уровнем до WPO10, Swing Time все еще значительно увеличивалась до значений Pre-OP на WPO12. Вопрос: p lt; 0,05 по сравнению с Pre-OP, No: p lt; 0.01 по сравнению с Pre-OP. Бары ошибок указывают ± стандартную погрешность среднего (SEM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 5: Boxplot курса печати области после седалищного повреждения нерва. Обратите внимание на экстремал (красный эллипс) на WPO12, что объясняется тем, что одно животное разработало сильные контрактуры правой задней лапы, начиная с WPO10. Таким образом, животное было исключено из статистического анализа, показанного на рисунке 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Бедренной нерв нейротмезисРесекция бедренной нерва приводит к денервации четырехглавой мышцыбедра 33,34. Вследствие этого нарушается расширение колена, что приводит к гиперфлексии голеностопного сустава при последовательном подъеме пятки лапы. Таким образом, область печати соответствующей лапы(рисунок 6B), сильно уменьшается после операции. РаспечататьМоть левой задней лапы увеличивается за счет компенсационного смещения веса влево. Это следует иметь в виду, так как это явление непосредственно влияет на расчетное соотношение между «экспериментальной» и «контрольной» лапой. Начиная с WPO4 reinnervation четырехглавой регенерирующей бедренной нерва приводит к развороту этих изменений в результате увеличения лапы печати области правой задней лапы (рисунок 7A). Как четырехглавой мышцы бедра также играет определенную роль в фазе качели соответствующей лапы, Swing Time(рисунок 7B) значительно длительное у крыс с травмой бедренной нерва. Отражая возвращение печати области, Swing Time уменьшается, как регенерирующий бедренной нерв достигает четырехглавой мышцы бедра. На WPO10 оба параметра походки вернулись к исходной линии, сигнализируя о полном функциональном восстановлении. Рисунок 6: Представитель лапы отпечатки. Представитель лапы отпечатки до (A) и следующие (B-E) правой бедренной нерва ресекции и ремонта аутотрансплантата. Распечатать Площадь RH сильно уменьшилась на WPO2 (B), в то время как увеличение площади печати левой задней лапы (LH) из-за повышенной нагрузки веса стало видимым. Rh Печатная площадь начала увеличиваться, начиная с WPO6(C) сопровождается уменьшением площади печати LH. На WPO8 (D) и WPO10 (E) Печатная область RH восстановилась обратно близко к предоперационных уровнях. (Адаптировано с разрешения Heinzel et al.22, лицензировано в соответствии с CC BY 4.0.) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 7: Курс функционального восстановления после 7-мм ресекции и аутотрансплантатного ремонта бедренной нерва. Курс коэффициента области печати(A) и коэффициент времени качания(B) показал сильное изменение сразу после ресекции бедренной нерва, но значения восстановились обратно к предоперационным значениям на WPO8. Вопрос: p lt; 0.05. Бары ошибок указывают среднее ± SEM. (Адаптировано с разрешения Heinzel et al.22, лицензировано в соответствии с CC BY 4.0.) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Ушиб спинного мозгаGait анализ показал заметно измененные отпечатки лап после травмы ушиба грудного спинного мозга(рисунок 8), наиболее примечательный decrement в области печати и заметное внутреннее вращение задних лап на WPO2 (Рисунок 8B). Примечательно, что вращение лапы также реализовано в качестве оценочной функции в BBB, подчеркивая применимость компьютеризированного анализа походки для оценки изменений походки, которые первоначально оценивались с помощью тестирования Open Field. Что касается хода отдельных параметров походки, ушиб спинного мозга на уровне Th11 привел к снижению коэффициента площади печати(рисунок 9A)и приращению коэффициента времени качели(рисунок 9B). Оба параметра в течение дальнейшего периода наблюдений были направлены к базовым уровням, однако статистически значимых изменений не наблюдалось. Связанный с координацией параметр Regularity Index(рисунок 9C)также снизился на WPO2, но степень сильно различалась между животными. Он также тенденции к предоперационных значений до WPO16. База поддержки задних лап(рисунок 9D), общий параметр походки по Deumens, показал заметное увеличение, которое было статистически значимым от WPO10 до WPO14. Он имеет тенденцию к базовым уровням на WPO16 и больше не был существенно изменен от значения Pre-OP на данный момент. Рисунок 8: Репрезентативные отпечатки лап двух задних лап. Лапа печатаетсяпредоперационно (A)и после травмы ушиба грудного спинного мозга(B-F). Обратите внимание на сокращение площади печати, начиная с WPO2 (B) сопровождается заметным внутренним вращением лап. В течение периода наблюдения(C-F)наблюдается приращение печатной области, а также зазор внутреннего вращения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 9: Ушиб спинного мозга на уровне Th 11. Ушиб спинного мозга в Th 11 привел к наблюдаемым изменениям коэффициента площади печати(A) и Swing Time(B) и индекса регулярности(C),но эти изменения не были статистически значимыми. После травмы, База поддержки задних лап показал заметное увеличение по сравнению с базовым, что было статистически значимым на WPO10 до WPO14. Вопрос: p lt; 0.05 по сравнению с Pre-OP. Бары ошибок указывают среднее ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Дополнительный файл 1: Устранение неполадок детали. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Оценка функционального восстановления в животных моделях PNI и SCI остается сложной из-за большого разнообразия методов оценки, каждый из которых имеет индивидуальные преимущества и недостатки. Лишь немногие подходы были протестированы и проверены в нескольких моделях периферических и центральных нервных травм, хотя перспективные новые методы, которые сочетают отслеживание движения и машинное обучение потенциально может продвинуть нейровиоальные исследования на следующий уровень функционального тестирования. Мы убеждены в том, что в скором времени появятся передовые методы, широко применимые к широкому кругу моделей животных и травм. В свете этих соображений одним из преимуществ AGA является возможность оценить функциональное восстановление в нескольких моделях повреждения нерва с помощью только одного устройства. С начала 2000-х годов этот подход был использован в экспериментальных моделях PNI, таких какседалищный 37, перонеальный38, и бедренной нервнойтравмы модели 22, а также после корневой авульсии как поясничного39 и брахиального сплетения40. Различные центральные нервные травмы, включая ушиб спинного мозга были также изучены сметодом 41,42. В этой статье мы представили подробный протокол о том, как вызвать три широко изученных нервных травм, а также как оценить функциональное восстановление после этого. На наш взгляд, практические рекомендации для исследователей, заинтересованных в области экспериментальной травмы нерва, ремонт, и регенерации о том, как сделать оптимальное использование выгодных особенностей метода будет иметь большую помощь.

Несколько авторов рассмотрели потенциал AGA для оценки функционального восстановления у грызунов, подчеркнув преимущество метода для одновременной оценки параметров походки, связанных с двигательной и сенсорнойреиннервации 27,28. Кроме того, сравнение данных с экспериментальной лапы, например, реконструированной травмы нерва неоперабельной лапы, как было показано в обеих представленных моделях, позволяет включить внутри животных положительный контроль. Обратно, оперировать лапу без хирургической реконструкции или дополнительного лечения может служить внутри животных отрицательный контроль. Было также показано, что можно объединить AGA с машинным обучением подходов43. Несмотря на преимущества метода, он также имеет ряд ограничений и недостатков, таких как трудоемкие усилия по обучению, которые являются обязательными, чтобы приучить животное кпроцедуре приобретения 28,44. Другим ограничением АГА является максимальный размер животных, имеющих право на тестирование из-за ограниченных размеров аппарата. Таким образом, использование AGA в настоящее время ограничивается животных размером с грызунов и хорьков45. Кроме того, в последнее время возникающие нейробехавиоальные подходы к оценке в области отслеживания движения, способные машинного обучения может превзойти AGA как по полноте,так и по возможным приложениям 18,19,46. Наиболее примечательным, но в соответствии с другими методами оценки, кажется, что функциональное восстановление, по оценке AGA сильно ограничено, если даже происходит- в моделях седалищного нерва neurotmesis47,48. С другой стороны, AGA позволяет провездную оценку хода функционального восстановления после нервного нерва бедренной кости, как показывают наши данные. С помощью этой работы мы продемонстрировали, что Paw Print Area является репрезентативным параметром походки, оцениваемым с помощью AGA, что является образцовым для хода функционального восстановления в двух вышеупомянутых моделях повреждения периферического нерва, представленных нами. В то время как функциональное восстановление ad integrum наблюдалось после аутотрансплантатного ремонта бедренной нерва, параметры AGA все еще были значительно изменены от исходного уровня в конце периода наблюдения после ремонта аутотрансплантата седалищного нерва. Примечательно, в этом контексте, что конечности контрактуры являются общим явлением у крыс с седалищной травмы нерва и осторожность необходимо не путать эти признаки мышечного дисбаланса и паралича с продолжениемфункционального восстановления 32. Это, с одной стороны, подчеркивает неспособность метода AGA обнаружить значительное функциональное восстановление после травмы neurotmesis в этой модели. С другой стороны, возникает вопрос, возможно ли оценить седалищного нерва травмы модели крысы, которая по-прежнему наиболее часто используется экспериментальная модель ремонта нерва, с помощью анализа походки в целом в случае, если повреждение нерва является более серьезным, чем axonotmesis48. Подробная информация об устранении неполадок представлена в дополнительном файле 1.

Мы также предоставили примерные данные об использовании метода для оценки функции локомотива у крыс с повреждением спинного мозга, что возможно без каких-либо необходимых изменений в аппаратной установке или процедуре приобретения. Тот же принцип применяется и к другим моделям грызунов центральной нервной травмы (CNI)26,49,50 и корневой травмы avulsion. В отличие от изолированных ПНИ, травмы спинного мозга являются гораздо более сложными в их патофизиологических последствий, как множество очень важных структур повреждены, с участием шипучих путей, таких как кортикоспинальные и руброспинальные тракты и афферентные пути, такие как спинные колонны и спиноталамическиетракты 35. Задача адекватно оценить эти патологические изменения находит свое отражение во всеобъемлющем арсенале поведенческих тестов, таких как Бассо, Битти и Бреснахан (BBB)оценка 36. Походка параметр Базы поддержки, как сообщается, увеличивается после центральных нервных травм, скорее всего, для учета в результате instable походка. База поддержки была значительно изменена с базового уровня от WPO10 до WPO14 в нашей модели, поддерживая нашу презумпцию того, что этот параметр позволяет оценить ход функционального восстановления AGA после ушиба грудного спинного мозга.

Мы убеждены, что AGA является возможным инструментом для оценки функционального восстановления у грызунов с травмами нервной системы. Тем не менее, мы советуем тщательно и тщательно отражать наблюдаемые изменения походки в каждой соответствующей экспериментальной установке. Изменения параметров походки, например, увеличение площади печати после немедленного послеоперационного сокращения или уменьшение времени качели, приступить к немедленному послеоперационному повышению этого параметра, в течение периода наблюдения не неизбежно связаны с функциональным восстановлением. Вместо этого эти изменения также могут быть связаны с возможной функциональной адаптации для поддержания незаметной походки, учитывая, что крысы являются добычей видов и попытаться избежать показа боли или инвалидности потенциальныххищников 51. Поэтому рекомендуется использовать автоматизированный анализ походки в качестве дополнительного инструмента для связи изменений походки с другими показателями исхода повреждения периферического нерва и регенерации21. Как упоминалось ранее, мы также считаем, что следует тщательно отразить, если грызуны с седалищным нервом нейротмезиса должны быть исследованы с помощью АГА, как наш вывод сильно указывает на то, что функциональное восстановление серьезно ограничено в этом случае.

Как показано в нашей работе, основным активом AGA является возможность изучения как двигательной, так и сенсорной реиннервации во множестве экспериментальных моделей PNI, а также CNI, требуя при этом только одной установки. Таким образом, метод, на наш взгляд, является весьма ценным инструментом для комплексного нейровиоального тестирования. Одним из активов AGA, который является возможность изучения двигательной и сенсорной реиннервации в различных животных моделях PNI и CNI, требуя при этом только одной установки, является, на наш взгляд, основным преимуществом метода по сравнению с другими методами оценки для изучения функционального восстановления, таких каканализ пешеходной дорожки 52, ФонФрей тестирования 53, или походка кинематики16. Потенциал одновременной оценки изменений походки, которые либо коррелируют с результатами электрофизиологических исследований рейннервированныхмышц 22, либо с методами оценки сенсорной функции 54, является перспективным в отношении будущих применений метода. Поэтому мы рекомендуем использовать AGA для исследования функционального восстановления в моделях грызунов forelimb PNI, таких как локтевой, радиальный, или средний нерв, или экспериментальныемодели передачи нерва 55, которые остаются неизученными с помощью этого метода еще.

В этой связи мы предоставляем подробный протокол о том, как использовать автоматизированный анализ походки для изучения функционального восстановления в трех моделях грызунов травмы нерва. Хотя метод требует тщательного рассмотрения различных ключевых аспектов, таких как надлежащая подготовка и тщательная калибровка жесткого и программного обеспечения, это осуществимый и ценный дополнительный инструмент для оценки регенерации нервов в моделях грызунов центральной и периферической травмы нерва.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить Карин Бреннер за ее страстный уход за животными. Авторы также хотели бы поблагодарить Клаудию Кейбл, Джеймса Фергюсона, Габриэле Лейнфеллнер и Сюзанну Дрехслер за помощь во время экспериментальных операций.

Materials

0.9% Saline B. Braun Austria 3570410 Vehicle for drug delivery
1 ml syringe B. Braun Austria 9161708V Injecting device
10 ml syringe B. Braun Austria 4606728 V Injecting device
1-Propanol, 2-Propanol, Hexetidin Gebro Pharma N/A Alcoholic skin disinfection
23-gauge (G) canula B. Braun Austria 4657667 Canula for s.c. injection
26-gauge (G) canula B. Braun Austria 4657683 Canula for s.c. injection
5 ml syringe B. Braun Austria 4606710 V Injecting device
Buprenorphine hydrochloride Sigma B9275 Analgetic agent
Burrs for Micro Drill F.S.T 19007-29 Drilling of a hole inside the lamina
Caprofen Zoetis Austria N/A Analgetic agent
Catwalk Automated gait analysis system Noldus N/A Automatic analysis software of animal gait
Cauterizer Kit F.S.T 18010-00 Cauterization of vessels during surgery
Enrofloxacin Bayer Austria N/A Antibiotic
Ethilon (10-0) ETHICON 2810G Suture material for neurrorhaphy
Ethilon (11-0) ETHICON EH7465G Suture material for neurrorhaphy
Eye ointment Fresenius Kabi Austria 4302436 Eye protection during anesthesia
Friedman-Pearson Rongeurs F.S.T 16221-14 Surgical instrument
Gabapentin Wedgewood Pharmacy N/A Analgetic agent
Goldstein retractor F.S.T 17003-03 Retraction of tissues during surgery
Hair trimmer Aescular N/A Hair trimmer for shaving of the operation site prior to surgery
Heating Pad for rodents ALA Scientific Instruments N/A Regulation of body temperature
Impactor Precision Systems and Instrumentation N/A Induction of spinal cord contusion
Lewis rat (Equation 1) Janvier N/A Experimental animal
Magnetic Fixator Retraction System F.S.T 18200-50 Retraction of tissues during surgery
Metzenbaum Baby Scissors F.S.T 14019-13 Surgical instrument
Micro Drill Word Precision Instruments 503599 Instrument for bone drilling
Micro Needle holder F.S.T 12076-12 Surgical instrument
Micro-scissors (curved) F.S.T 15023-10 Surgical instrument
Micro-scissors (straight) F.S.T 15007-08 Surgical instrument
Mirror Finish Forceps F.S.T 11251-23 Surgical instrument
Needle holder F.S.T 12002-12 Surgical instrument
Operating microscope Leica M651 MSD Magnification of the operative site
Povidone Iod B. Braun Melsungen N/A Non-alcoholic skin disinfectant
Pulse Oximeter STARR Life Sciences N/A Surveillance of heart rate and oxygen saturation
Rodent thermometer BIOSEB BIO-TK8851 Surveillance of body temperature
Scalpel blade F.S.T 10010-00 (#10) Surgical instrument to make an incision
Scalpel handle F.S.T 10003-12 (#3) Surgical instrument to make an incision
Sevoflurane Inhalation Vapour, Liquid (100%) Baxter HDG9117A Anesthetic
Spatula & Probe F.S.T 10090-13 Surgical instrument
Sprague Dawley rat (Equation 1) Janvier N/A Experimental animal
Sterila gauze 5x5cm EVAC MEDICAL E010.03.00215 Sterile gauze compress
Tissue Forceps F.S.T 11021-12 Surgical instrument
Vicryl (4-0) ETHICON V3040H Suture material for subcutaneous sutures
Vicryl (5-0) ETHICON V303H Suture material for subcutaneous sutures
Vicryl cutting needle (4-0) ETHICON V392ZH Suture material for skin sutures
Vicryl cutting needle (5-0) ETHICON V391H Suture material for skin sutures
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mohanty, C. B., Bhat, D. I., Devi, B. I. Use of animal models in peripheral nerve surgery and research. Neurology India. 9, 100-105 (2019).
  2. Vela, F. J., et al. Animal models used to study direct peripheral nerve repair: a systematic review. Neural Regeneration Research. 15 (3), 491-502 (2020).
  3. Verma, R., Virdi, J. K., Singh, N., Jaggi, A. S. Animals models of spinal cord contusion injury. The Korean Journal of Pain. 32 (1), 12-21 (2019).
  4. de Medinaceli, L., Freed, W. J., Wyatt, R. J. An index of the functional condition of rat sciatic nerve based on measurements made from walking tracks. Experimental Neurology. 77 (3), 634-643 (1982).
  5. Navarro, X. Functional evaluation of peripheral nerve regeneration and target reinnervation in animal models: a critical overview. The European Journal of Neuroscience. 43 (3), 271-286 (2016).
  6. Sperry, R. W. The functional results of muscle transposition in the hind limb of the rat. The Journal of Comparative Neurology. 73 (3), 379-404 (1940).
  7. Sperry, R. W. The effect of crossing nerves to antagonistic muscles in the hind limb of the rat. The Journal of Comparative Neurology. 75 (1), 1-19 (1941).
  8. Sperry, R. W. Transplantation of motor nerves and muscles in the forelimb of the rat. The Journal of Comparative Neurology. 76 (2), 283-321 (1942).
  9. Zimmerman, E. A., Chambers, W. W., Liu, C. N. An experimental study of the anatomical organization of the Cortico-Bulbar System in the Albino Rat. The Journal of Comparative Neurology. 123, 301-323 (1964).
  10. Cohen, A. H., Gans, C. Muscle activity in rat locomotion: movement analysis and electromyography of the flexors and extensors of the elbow. Journal of Morphology. 146 (2), 177-196 (1975).
  11. Barnett, S. A. . The Rat: A Study in Behaviour. , (1963).
  12. Hare, G. M., et al. Walking track analysis: utilization of individual footprint parameters. Annals of Plastic Surgery. 30 (2), 147-153 (1993).
  13. Hare, G. M., et al. Walking track analysis: a long-term assessment of peripheral nerve recovery. Plastic and Reconstructive Surgery. 89 (2), 251-258 (1992).
  14. Bertelli, J. A., Mira, J. C. Behavioral evaluating methods in the objective clinical assessment of motor function after experimental brachial plexus reconstruction in the rat. Journa of Neuroscience Methods. 46 (3), 203-208 (1993).
  15. Varejao, A. S., Melo-Pinto, P., Meek, M. F., Filipe, V. M., Bulas-Cruz, J. Methods for the experimental functional assessment of rat sciatic nerve regeneration. Neurological Research. 26 (2), 186-194 (2004).
  16. Varejao, A. S., et al. Functional assessment of peripheral nerve recovery in the rat: gait kinematics. Microsurgery. 21 (8), 383-388 (2001).
  17. Varejao, A. S., et al. Ankle kinematics to evaluate functional recovery in crushed rat sciatic nerve. Muscle and Nerve. 27 (6), 706-714 (2003).
  18. Nath, T., et al. Using DeepLabCut for 3D markerless pose estimation across species and behaviors. Nature Protocols. 14 (7), 2152-2176 (2019).
  19. Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neuroscience. 21 (9), 1281-1289 (2018).
  20. Deumens, R., Jaken, R. J., Marcus, M. A., Joosten, E. A. The CatWalk gait analysis in assessment of both dynamic and static gait changes after adult rat sciatic nerve resection. Journal of Neuroscience Methods. 164 (1), 120-130 (2007).
  21. Heinzel, J., et al. Use of the CatWalk gait analysis system to assess functional recovery in rodent models of peripheral nerve injury – a systematic review. Journal of Neuroscience Methods. 345, 108889 (2020).
  22. Heinzel, J. C., Hercher, D., Redl, H. The course of recovery of locomotor function over a 10-week observation period in a rat model of femoral nerve resection and autograft repair. Brain and Behavior. , 01580 (2020).
  23. Chen, S. H., et al. Changes in GABA and GABA(B) receptor expressions are involved in neuropathy in the rat cuneate nucleus following median nerve transection. Synapse. 66 (6), 561-572 (2012).
  24. Chen, S. H., et al. Decreases of glycine receptor expression induced by median nerve injury in the rat cuneate nucleus contribute to NPY release and c-Fos expression. Life Sciences. 90 (7-8), 278-288 (2012).
  25. Hetze, S., Romer, C., Teufelhart, C., Meisel, A., Engel, O. Gait analysis as a method for assessing neurological outcome in a mouse model of stroke. Journal of Neuroscience Methods. 206 (1), 7-14 (2012).
  26. Sandner, B., et al. Systemic epothilone D improves hindlimb function after spinal cord contusion injury in rats. Experimental Neurology. 306, 250-259 (2018).
  27. Kappos, E. A., et al. Validity and reliability of the CatWalk system as a static and dynamic gait analysis tool for the assessment of functional nerve recovery in small animal models. Brain and Behavior. 7 (7), 00723 (2017).
  28. Deumens, R., Marinangeli, C., Bozkurt, A., Brook, G. A. Assessing motor outcome and functional recovery following nerve injury. Methods in Molecular Biology. 1162, 179-188 (2014).
  29. Webster, G. V. Halstedian principles in the practice of plastic and reconstructive surgery. Stanford Medical Bulletin. 13 (3), 315-316 (1955).
  30. Bozkurt, A., et al. A flexible, sterile, and cost-effective retractor system for microsurgery. Microsurgery. 31 (8), 668-670 (2011).
  31. Carr, M. M., Best, T. J., Mackinnon, S. E., Evans, P. J. Strain differences in autotomy in rats undergoing sciatic nerve transection or repair. Annals of Plastic Surgery. 28 (6), 538-544 (1992).
  32. Dellon, A. L., Mackinnon, S. E. Sciatic nerve regeneration in the rat. Validity of walking track assessment in the presence of chronic contractures. Microsurgery. 10 (3), 220-225 (1989).
  33. Jackson, C. M. Anatomy of the rat. Transactions of the American Philosophical Society, Philadelphia, New Series, Volume XXVII, 1935. The Anatomical Record. 65 (1), 127-129 (1936).
  34. Pena, M. C., Baron, J. Femoral nerve and rectus femoris muscle of the rat: a study in anatomy, histology, and histoenzymes. Annals of Plastic Surgery. 20 (6), 527-532 (1988).
  35. Kjell, J., Olson, L. Rat models of spinal cord injury: from pathology to potential therapies. Disease Models and Mechanisms. 9 (10), 1125-1137 (2016).
  36. Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
  37. Bozkurt, A., et al. CatWalk gait analysis in assessment of functional recovery after sciatic nerve injury. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 91-98 (2008).
  38. Godinho, M. J., et al. Immunohistochemical, ultrastructural and functional analysis of axonal regeneration through peripheral nerve grafts containing Schwann cells expressing BDNF, CNTF or NT3. PLoS One. 8 (8), 69987 (2013).
  39. Pajenda, G., et al. Spatiotemporally limited BDNF and GDNF overexpression rescues motoneurons destined to die and induces elongative axon growth. Experimental Neurology. 261, 367-376 (2014).
  40. Matsuura, Y., et al. The effect of anti-NGF receptor (p75 Neurotrophin Receptor) antibodies on nociceptive behavior and activation of spinal microglia in the rat brachial plexus avulsion model. Spine (Phila Pa 1976). 38 (6), 332-338 (2013).
  41. Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
  42. Koopmans, G. C., et al. The assessment of locomotor function in spinal cord injured rats: the importance of objective analysis of coordination. Journal of Neurotrauma. 22 (2), 214-225 (2005).
  43. Frohlich, H., Claes, K., De Wolf, C., Van Damme, X., Michel, A. A machine learning approach to automated gait analysis for the Noldus Catwalk system. IEEE Transaction on Bio-medical Engineering. 65 (5), 1133-1139 (2018).
  44. Batka, R. J., et al. The need for speed in rodent locomotion analyses. Anatomical Record (Hoboken, N. J). 297 (10), 1839-1864 (2014).
  45. Wood, T., et al. A ferret model of encephalopathy of prematurity. Developmental Neuroscience. 40 (5-6), 475-489 (2018).
  46. Abbas, W., Masip Rodo, D. Computer methods for automatic locomotion and gesture tracking in mice and small animals for neuroscience applications: a survey. Sensors. 19 (15), (2019).
  47. Irintchev, A. Potentials and limitations of peripheral nerve injury models in rodents with particular reference to the femoral nerve. Annals of Anatomy. 193 (4), 276-285 (2011).
  48. Haastert-Talini, K., Haastert-Talini, K., Assmus, H., Antoniadis, G. . Modern Concepts of Peripheral Nerve Repair. , 127-138 (2017).
  49. Lu, L., et al. Growth differentiation factor 11 promotes neurovascular recovery after stroke in mice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, (2018).
  50. Caballero-Garrido, E., Pena-Philippides, J. C., Galochkina, Z., Erhardt, E., Roitbak, T. Characterization of long-term gait deficits in mouse dMCAO, using the CatWalk system. Behavioral Brain Research. 331, 282-296 (2017).
  51. Graham, D. M., Hampshire, V. Methods for measuring pain in laboratory animals. Lab Animal. 45 (3), 99-101 (2016).
  52. Monte-Raso, V. V., Barbieri, C. H., Mazzer, N., Yamasita, A. C., Barbieri, G. Is the sciatic functional index always reliable and reproducible. Journal of Neuroscience Methods. 170 (2), 255-261 (2008).
  53. Stossel, M., et al. Comparative evaluation of chitosan nerve guides with regular or increased bendability for acute and delayed peripheral nerve repair: a comprehensive comparison with autologous nerve grafts and muscle-in-vein grafts. Anatomical Record (Hoboken). 301 (10), 1697-1713 (2018).
  54. Vrinten, D. H., Hamers, F. F. CatWalk’ automated quantitative gait analysis as a novel method to assess mechanical allodynia in the rat; a comparison with von Frey testing. Pain. 102 (1-2), 203-209 (2003).
  55. Aman, M., Sporer, M., Bergmeister, K., Aszmann, O. Animal models for selective nerve transfers of the upper extremity. Handchirurgie Mikrochirurgie Plastische Chirurgie. 51 (4), 319-326 (2019).

Tags

Automated Gait AnalysisPeripheral Nerve InjurySpinal Cord Contusion InjuryFunctional RecoveryMotor Nerve FunctionSensory Nerve FunctionAnimal TrainingHardware And Software CalibrationWalkwayPaw Print DetectionData Acquisition

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Heinzel, J., Swiadek, N., Ashmwe, M., Rührnößl, A., Oberhauser, V., Kolbenschlag, J., Hercher, D. Automated Gait Analysis to Assess Functional Recovery in Rodents with Peripheral Nerve or Spinal Cord Contusion Injury. J. Vis. Exp. (164), e61852, doi:10.3791/61852 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image