末梢神経または脊髄損傷を伴うげっ歯類の機能回復を評価する自動歩行分析

すべての実験のための実験議定書は、ウィーン市政府の動物議定書審査委員会によって事前に承認されました。すべての手順は、動物の権利に関するヘルシンキ宣言と国立衛生研究所の実験動物のケアと使用のためのガイドに完全に従って行われました。 1. 動物住宅 ハウス雄ラット(ルイスまたはスプレイグ・ドーリー)は、食料と水へのアドリビタムアクセスで12時間の明暗サイクルの下で250〜300 gの重量を量る。 室温(20~22 °Cに維持)と湿度(45%~65%)の両方を制御する十分な動物のハウジングのために。この研究のために、オスのルイス(PNI)およびスプレイグ・ドーリー(SCI)ラットが使用された。 週に2回、新しい、クリーニングされたケージを提供します。2つまたは3つのグループでラットを収容し、密接に彼らの社会的行動や相互作用を監視します。ラットは、外科的処置または機能検査の前に少なくとも1週間の順応期間を許可する。注:ラットは手術前に歩行分析装置で少なくとも5日間の毎日の訓練を必要とするので、施設でのラットの到着と実験手術28の予定データの間に少なくとも2週間を計算する。 2. 神経損傷の誘導 注意:外科用ガウン、手袋、マスクなどの個人用保護具を着用してください。無菌の外科用ガウンが利用できない場合には、清潔で洗濯されたラボコートも十分です。それが汚染されない限り、ガウンやコートは動物間で、手術セッションの間に変更する必要はありません。滅菌外科用手袋の使用をお勧めします。そのような手袋が利用できない場合、検査用手袋も使用できますが、手術用消毒剤を使用して手術前に洗浄する必要があります。手袋は動物間で交換する必要があります。 手術当日、麻酔を妨げる可能性があるため、動物へのストレスを最小限に抑えるようにしてください。 手術当日、手術前および手術前の鎮痛を提供するために、手術前に25 Gカヌラ1時間を使用して100-200 μL 0.9%NaClを皮下に使用して、サスペンションに0.05mgのブプレノルフィン/kg体重を注入します。そうでない場合、ラットの脇腹は注射の好ましい部位である。 ラットを麻酔誘導室に入れて、セボフルラン気化器と活性チョーク容器に接続してCO2を吸収する。麻酔ボックスに4%~5%のセボフルラン-酸素混合物を約5分間浸水させ、酸素流量1.5L/min(開始期)で麻酔を行い、ラットを麻酔します。パルスオキシメトリークリップを足の1つに接続して、げっ歯類の血中酸素飽和度を監視します。2.5%~4.5%のセボフルラン-酸素混合物で全身麻酔の状態を維持します。メモ:実験手術の場合、全身麻酔は義務付けられています。尾や足のピンチ刺激に対する応答の欠如を確認することによって全身麻酔を確認します。 ラットが全身麻酔に入ったら、操作されるそれぞれのアリアルを剃り、アルコールと皮膚消毒剤で交互にスワイプして領域を消毒する。最後のスワイプは、皮膚消毒剤で行う必要があります。 必要な位置に調節可能な加熱パッドの上に置きます(大腿神経モデルの場合は、坐骨神経およびSCIモデルの場合に起こりやすい)。ラットの直腸に柔軟な温度計プローブを挿入して、動物の温度を監視し、手術中に約37°Cで維持します。麻酔中、眼軟膏を用いてラットの目を乾燥から守る 3. 神経損傷の外科的誘導 外科的処置を行う場合は、次のようにハルステッド29 の7原則に厳密に従ってください。 彼らと一緒に作業するときは、常に穏やかに組織を処理します。組織を引き裂いたり破ったりすることは避けてください。注意:自作30 または市販のリトラクタシステムは、筋肉や血管を操作場から締め出すために役立ちます。 慎重に止止めを保証するために容器や合字を焼灼するために電気止結体を使用して止止めを慎重に維持します。 常に慎重にそれらを解剖し、繊細にそれらを処理することによって、組織への血液供給を維持します。 マスク、ガウン、無菌手袋を着用して厳格な敗血症を維持します。 ティッシュの緊張を避けるには、きつすぎず緩みすぎない縫合糸を適用します。 重なり合うことなくそれぞれのエッジを一緒に持って来ることによって、細心の注意を払って組織をアポシング。注:これは、上皮性または過敏性神経刺激症の場合に特に重要です。手術顕微鏡を使用して、6x-16倍の拡大の下ですべての微小手術手順を実行します。理想的には、顕微鏡は助手による操作の観察を可能にするために2つの対の眼を提供する。 異なる組織層を慎重に縫合することにより、死んだ空間の作成を避けてください。 右後肢神経神経症の誘導 #3のメスハンドルに接続された#10メスの刃で後肢の後部に5cmの長い切開を行い、上にある筋肉と軟部組織を解剖することによって、中腿レベルで右坐骨神経を露出させる。解剖された筋肉と皮膚を座り込まないように、傷口の中にレトラクターを置きます。湾曲したマイクロサージカルハサミを使用して周囲の組織を取り除くことによって、神経を穏やかに露出させる。 坐骨神経の長さ8 mm の神経セグメントを取り除き、その支軸に近い 1 ~ 2 mm の間にまっすぐなマイクロ外科用はさみで。 神経セグメントを180°回転させ、経外科神経の近位および遠位の切り株の間に置き、2つの中断された10-0縫合糸とマイクロ外科針ホルダーを備えた各部位で上聴神経神経刺激を行います。 右後肢における大腿神経障害の誘導 右の大腿神経血管束を露出させるために、#3メスハンドルに接続された#10のメスブレードで縦方向の3〜4cmの鼠径部切開を行います。大腿神経の分岐が露出するまで、鈍い解剖のために外科用はさみを使用する。解剖された筋肉と皮膚を座り込まないように、傷口の中にレトラクターを置きます。 露出した運動および感覚分岐を分岐に遠位し、各枝の6mm長い神経セグメントをそれぞれ切除し、まっすぐな微小手術ハサミを使用する。 両神経セグメントを180°回転させ、経部大腿神経枝の近位および遠位の切り株の間に置き、2つの中断された11-0縫合糸とマイクロ外科針ホルダーを備えた各部位で上聴神経神経学を行います。注:元の運動枝に運動移植片を移植し、感覚移植片を元の感覚枝に移植することによって、同様体の自己神経移植を行います。あるいは、運動移植片を元の感覚枝に移植し、その逆にして異所性自立神経移植片を行う。 胸部脊髄損傷の誘発 #3メスハンドルに接続された#10メスの刃で胸部脊柱全体の皮膚切開を行い、その後、2つの筋肉切開を棘プロセスと並行して行い、筋肉の引き込みを容易にする。解剖された筋肉と皮膚を座り込まないように、傷口の中にレトラクターを置きます。 11番目の胸椎(Th)を特定し、上にある組織と、ロンゲルを使用してスピナスプロセスを除去することによって、椎骨アーチの層を露出させます。 マイクロドリルと適切なバリを使用してラミネクトミーを行い、インサータの先端よりわずかに大きい薄層に小さな穴を開けます。脊髄の損傷を防ぐために、ロンガを使用して穴を開けて大きくしながら、薄層のみを薄くします。骨膜がまだ無傷の場合は、硬膜を損傷することなく、鋭利な尖ったプローブを使用して慎重に取り外します。 ラミナを不安定にすることなく十分な大きさの穴が作られるようにした後、動物の脊柱をロストレクラリーにクランプし、インコプタの安定化鉗子でTh11に詰め込みます。フロントとサイドのハンドホイールを使用して、鋼ロッドをラミニング孔の上に3〜5mm配置します。最後に、すべての動物に150キロダインの定義された力で衝撃を与え、軽度から中程度の脊髄失禁傷害を誘発する。 ポリグラクチン4-0または5-0中断縫合糸と手術用針ホルダーを使用して、解剖学的層で創傷閉鎖を行います。滅菌0.9%NaClに浸したガーゼパッドで軽く拭いて傷を十分にきれいにします。 手術後、動物を自宅のケージに戻し、光と音の露出から保護します。術後日(DPO)7まで動物の行動を注意深く監視し、十分な食料と水の摂取を保証する。必要に応じて、皮下注射(例えば、10 ml NaCl 0.9%)によって追加の液体を提供する。 術後鎮痛を最低2日間提供し、例えば、オピオイド(0.05mg/kg体重ブプレノルフィン皮下(.c))および/または解熱剤(4mg/kg体重カルプロフェン.c)必要に応じて、SCIモデルの場合、術後抗生物質療法(7.5mg/kg体重1os(p.o.))を提供する。 脊髄損傷の場合は、自発的な排尿が戻るまでラットの膀胱を手動で空にする。 4. 歩行分析前の外科的介入からの回復 注意:坐骨神経損傷を有するラットは、神経損傷後の痛みを伴う神経障害の発症のために後足をかじる傾向を示す。この形式の自動切断は、それぞれの後足のつま先または部分の自動切断をもたらす可能性があります。坐骨神経損傷モデルを使用する場合に備えて他のラット株よりもルイスラットを好む、このラット株は、自家突然変異31の小さい傾向を示すように。坐骨神経損傷を有するラットはまた、操作された四肢の拘縮を発症する傾向を示し、データ取得の干渉による研究からの排除をもたらす可能性がある。このような有害事象は、大腿骨損傷を有するラットではあまり一般的に起こらない。 手術後の手術後、毎日、手足と足の状態に特に注意を払って手術動物を検査する。注意:SCIを有するラットでは、Th11の高さで、陰茎または直腸脱は、動物の排尿および排便能力の障害のために起こり得る。これらの事象は、一般的に研究のヒトエンドポイントとして定義され、研究から影響を受けた動物を即時に排除していることを暗示する。 ラットが痛み関連の症状を表示しなくなるまで術後の鎮痛を続ける。 持続的な痛みの場合, ガバペンチンを投与 (30-120 mg/kg体重) p.o. 神経因性疼痛を治療します。 5. 自動歩行分析を行う前の準備 注:歩行分析システムの方法論は、緑色のLEDライトで照らされたガラス板を横切りながら、下から動物を記録することにあります。動物の足が床に接触すると、足のプリントの領域が照らされ、高速ビデオカメラによって記録されます。このデータは、イーサネットケーブルを介して、歩行解析ソフトウェアを実行しているコンピュータに送信されます。個々のフットプリントは実験者によって手動で分類できますが、最新のソフトウェアバージョンには自動フットプリント分類も含まれています。 暗闇の中で、不穏な騒音がない場合は、すべてのテスト手順を実行します。ラットは超音速周波数を知覚することができるので、そのような音を発するソースがないことを確認します。注:毎週または隔週で歩行分析を行いますが、特にルイスラットがあまりにも頻繁に特定の運動にさらされると、時間の経過とともに手順に参加することに興味を失う傾向があるため、ラットを頻繁にテストしないでください。しかし、手術前に5日間毎日ラットをトレーニングし、検査環境と手順に順応させる必要があります。 トレーニングセッション中やテスト当日に、すべての光源をオフにして行動テストルームを準備します。カメラから離れた場所にデータ取得に必要なコンピュータ画面を配置して、カメラに光が干渉しないようにします。 デバイスが安定した位置に設置され、データ取得手順に重大な影響を与えるため、あらゆる形態の振動を防ぐ方法で設置されていることを確認してください。 ラットを行動検査室に持ち込み、テストの前に少なくとも30分間、自分の家のケージに入れます。注意:動物を扱う際は、手術用ガウンやラボコート、手袋、マスクなどの個人用保護具を着用してください。 6. 自動歩行解析の実行 トレーニングセッション注:トレーニング中は、動物は学習曲線を受け取るので、トレーニングスケジュールを徐々に調整することをお勧めします。各トレーニングセッションが正常に完了した後、動物に報酬を与えるために、食べ物の報酬(例えば、1〜2個の朝食シリアル)を使用してください。 訓練の初日に、動物を幹の下に持ってそっと持ち上げ、歩道の入り口にそっと運びます。 入り口エリアに動物を配置し、それはテスト手順を実行する人からの干渉なしに廊下の開口部を探索してみましょう。注:歩道を渡るためにそれを動機づけるために動物を叫んだり、笛を吹いたり、吹いたり、突いたりしないでください。このような行動はすべて、動物に深刻なストレスを与え、データ取得手順をさらに複雑にします。 動物が自発的にその家のケージに到達するために歩道を横切るまで待ちます。時には、特に訓練されていない動物では、これは数分かかることがあります。最初の訓練日には、動物は均一な歩行速度で途切れない走りをすることは期待されておらず、必要もありません。代わりに、それはテスト装置と手順で自分自身を順応する必要があります。 訓練の2日目には、動物はためらうことなく歩道に入り、またためらうことなく自宅のケージに戻ることを慣らします。一部の動物はおそらくすでに中断することなく歩道を横断することを学んでいるでしょうが、これはまだ2日目の終わりには必要ありません。 訓練の3日目に、動物がためらい、スニッフィング、またはその他の探索的な動きなしに歩道を横断することを学ぶことを確認してください。彼らは均一な速度で歩くことを確認してください。 トレーニングの 4 日目と 5 日目に、前の演習を繰り返してテスト手順を統合します。注意:動物が5日間のトレーニング期間の終わりまでに歩道を適切に横断するために必要なスキルを習得していない場合は、トレーニングの2日(例えば、週末)を追加します。また、1日に3回までのトレーニングセッションを、個々のセッション間で少なくとも2時間の休息で区切って実施することを検討してください。症例の95%では、動物はこの延長訓練期間の終わりまでに必要な訓練経験を獲得しているであろう。まれに、動物が7日間の訓練の後にまだこのスキルを習得していない場合、計画された実験手術セッションを少なくとも1週間延期し、前述の訓練体制を繰り返すことを推奨する。 7. データ取得 注:歩行解析システムは、動物が歩いている間に各足のプリントを視覚化し、自動的に足のプリント領域、足の印刷強度、足のスイング時間、および足のスイング速度(表1)などの様々な歩行パラメータを分析します。歩行分析システムは、動物の足のプリントによって生成された強度に基づいてすべてのデータを記録するので、カメラの設定がラットの体重とサイズに応じて調整されていることを確認してください。さらに、データの取得に影響を与えないように、データ記録の前に歩道が乾燥して清潔であることを確認してください。 データを取得する前に、市販のガラスクリーナーとスキージを使用して歩道を清掃してください。ガラス板を数回スプレーし、スキージで拭き取り、表面から粒子を取り除きます。また、下を清掃してください。動物が歩き、記録されたデータに影響を与える可能性があるため、歩道の端から流体を取り除いてください。 必要に応じて、例えば、歩道の汚染と別のケージからのラットのデータの記録前に、洗浄手順を繰り返します。これは、動物が彼らの特異性の香りに気を取られるのを防ぐと考えられています。 最初のデータ取得の前に、動物の体重に合わせてカメラの設定を調整してください。最も軽くて重い動物を歩道に置いて確認し、どちらの場合も良好なデータ品質を可能にするカメラ設定を選択します。最適な足のプリント検出を確実にするために、カメラゲイン、赤天井ライト、緑の歩道ライト、およびグリーン強度しきい値(GIT)を調整します。注意: 取得したデータの比較が妨げられるため、データ取得の開始後に選択した設定を変更しないでください。例外として、データ分類中に GIT を変更できますが、これはすべての試行に対して一様に行う必要があります。 用意されているキャリブレーションシートを使用して、歩道を定義し、較正します。 [ 設定 ]タブに表示されている登録済みのカメラを選択します。 [取得]タブにある[取得を開く] ボタンをクリックします。 次のデータ取得手順を通じて参照として使用される、空のクリーニングされた歩道のスナップショットを作成します。 状態が [スナップショットの待機中] から [取得準備完了]に変わります。 [取得の 開始 ] ボタンをクリックし、ステータスが [取得の準備完了] から [ 実行開始を待っている] に変わったことに注目します。 歩道にネズミを置き、コンピュータ画面上の動物の動きに従ってください。状態が [ 実行の待機中] から [記録の開始] から [記録実行] に変わります。注: ソフトウェアは、緑色のシンボルでプリセット実行特性に従って準拠とみなす実行を自動的に分類し、非準拠の実行には赤い記号が付きます。ソフトウェアは、3 つの準拠した実行が記録されたときに自動的にデータの取得を停止しますが、データの取得を続行するには、もう一度 取得 開始ボタンをクリックします。 8. データ分類 注: AGA 結果パラメータのリストについては、 表 1 を参照してください。動物が27をためらうことなく着実に歩道を横断しなければならない少なくとも3つの準拠した実行が必要です。さらに、走行速度は、文献30で定義されているのと同じカテゴリ内で一致する必要があります。 分類する各試験の「実験エクスプローラー 」タブの「分類」ボタンをクリックします。 データが前に記載されている要件に準拠しているかどうか印象を得るために通常の速度で取得した実行を再生します。 左上隅で、ソフトウェアによる足のプリントの自動分類を行う 自動分類 ボタンをクリックします。注:ソフトウェアは正しい足の分類の高い率を持っていますが、時にはプリントに足を割り当てることに失敗したり、間違った足を割り当てます。したがって、自動分類された足のプリントは、その後必ず再確認してください。 通常ステップシーケンスパターン(NSSP)の正しい計算を行うために、分類アルゴリズムが見えない足のプリントと混同され、NSSPに欠陥が生じないようにしてください(図1A)。したがって、NSSP計算のために対側足も見える間に検出可能な足のプリントのみを含む、例えば、左前足(LF)および右後足(RH)(図1B)。 図1:例示的なAGAデータは、正しいデータ分類の手動による二重検査の必要性を示す。前足の検出された配置が別の前足の検出された配置によって成功した場合(A)、後足が検出されていないので、AGAソフトウェアはこれを調整されていない歩行パターンと混同する可能性があります。したがって、常にダブルチェックし、反対の足も見えるときに検出される最初の足のプリントを選択することをお勧めします(B)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 9. 統計の計算 注: 時間の経過に伴う体重増加に関する変化の実行データを調整するには、実験用足の比を非実験的(コントロール)足で計算することを強くお勧めします。さらに、足の使用における個人差を考慮するために、この足と足の比較の術前値に対する比率を計算する。 [ 実行統計の表示 ] ボタンをクリックすると、実行統計の概要が表示されます。 実行統計または試用版の統計をスプレッドシート ソフトウェアにエクスポートするには、[ ファイル と エクスポート ] を選択します。