Remoção e Substituição de Ligantes Endógenos de Proteínas e Alérgenos Lipid-Bound
Summary
Este protocolo descreve a remoção de lipídios endógenos de alérgenos, e sua substituição por ligantes especificados pelo usuário através de HPLC de fase inversa, juntamente com ressarcimento térmico. 31 P-NMR e dicromaísmo circular permitem a confirmação rápida da remoção/carregamento de ligantes e a recuperação da estrutura de alergênicos nativos.
Abstract
Muitos alérgenos principais se ligam a moléculas hidrofóbicas semelhantes a lipídios, incluindo Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 e Fel d 1. Esses ligantes são fortemente retidos e têm o potencial de influenciar o processo de sensibilização, seja estimulando diretamente o sistema imunológico ou alterando as propriedades biofísicas da proteína alergênica. Para controlar essas variáveis, são necessárias técnicas para a remoção de ligantes endógenos e, se necessário, substituição por lipídios de composição conhecida. O alérgeno da barata Bla g 1 inclui uma grande cavidade hidrofóbica que une uma mistura heterogênea de lipídios endógenos quando purificado usando técnicas tradicionais. Aqui, descrevemos um método através do qual esses lipídios são removidos usando HPLC de fase reversa seguido de ressarcimento térmico para produzir Bla g 1 em sua forma Apo ou recarregado com uma mistura definida pelo usuário de ácido graxo ou cargas fosfolipídicas. Acoplamento deste protocolo com ensaios bioquímicos revela que as cargas de ácidos graxos alteram significativamente a termoestabilidade e a resistência proteolítica de Bla g 1, com implicações a jusante para a taxa de geração de epítopes de células T e alergenicidade. Esses resultados destacam a importância de protocolos de remoção/recarga lipídica, como o aqui descrito ao estudar alérgenos de fontes recombinantes e naturais. O protocolo é generalizável para outras famílias alérgenas, incluindo lipocalinas (Mus m 1), PR-10 (Aposta v 1), MD-2 (Der p 2) e Uteroglobina (Fel d 1), fornecendo uma ferramenta valiosa para estudar o papel dos lipídios na resposta alérgica.
Introduction
Um levantamento do banco de dados de alérgenos revela que os alérgenos são encontrados em apenas 2% de todas as famílias de proteínas conhecidas, sugerindo que propriedades funcionais e biofísicas comuns contribuem para a alergenicidade1. Dessas propriedades, a capacidade de vincular cargas lipídicas parece estar fortemente super-representada entre os alérgenos, sugerindo que essas cargas podem influenciar o processo de sensibilização1. De fato, foi demonstrado que o alergênico Brazil Nut Ber e 1 requer coadministração com seu lipídio endógeno para realizar seu potencial de sensibilização plena2. Esses lipídios poderiam potencialmente estimular o sistema imunológico diretamente como ilustrado pelos alérgenos ácaros Der p 2 e Der p 7, ambos compartilhando uma forte homologia estrutural com proteínas de ligação LPS3,4,5. Com base nessa observação foi proposto que o Derp 2 e o Der p 7 poderiam ligar lipídios bacterianos e estimular diretamente o sistema imunológico hospedeiro através da sinalização mediada pelo TLR4, facilitando o processo de sensibilização5,6. Também é possível que lipídios endógenos ligados possam alterar as propriedades biofísicas das próprias proteínas alergênicas. Por exemplo, a capacidade de Sin a 2 (mostarda) e Ara h 1 (amendoim) de interagir com vesículas fosfolipítidas aumentou significativamente sua resistência à degradação gástrica e endossomal7,enquanto ligante ao alergênico principal do pólen de bétula Bet v 1 alterou tanto a taxa de processamento endosomal quanto a diversidade dos peptídeosresultantes 8. Isso é particularmente relevante para a alergenicidade dada a correlação observada entre estabilidade, geração de epítopes de células T e alergenicidade para proteínas como Bet v 1 e Bla g 1; este último será o tema deste trabalho9,10.
Bla g 1 representa o membro prototípico da família de proteínas do inseto Major Allergen (MA), e possui uma estrutura única composta de 12 helices alfa anfípáticas que incluem uma cavidade hidrofóbica anormalmente grande9,11. A estrutura de cristal de raios-X disponível de Bla g 1 mostra densidade eletrônica dentro desta cavidade consistente com ligantes fosfolipídid ou ácidos graxos ligados; uma conjectura confirmada por 31P-NMR e espectrometria de massa. Essas cargas eram de natureza heterogênea e sua composição dependia fortemente da fonte alérgica, com diferentes perfis lipídicos observados para recombinante Bla g 1 expresso em E. coli e P. pastoris. Curiosamente, Bla g 1 purificado de sua fonte de alérgeno natural (barata frass) continha ácidos predominantemente graxos dentro de seu local de ligação, com uma mistura de palmitato, oleato e estearato sendo identificado como seus ligantes “naturais”9,11. A capacidade de Bla g 1 de reter lipídios e ácidos graxos após múltiplas etapas de purificação dificulta os esforços para estudar a proteína isoladamente. Por outro lado, tem sido sugerido que os ligantes palmitato, estelato e oleate naturais de Bla g 1 (a partir de agora referido como nMix) desempenham um papel fundamental tanto em sua alergenicidade quanto na função biológica nativa9. No entanto, esses ligantes não estão presentes no Bla g 1 obtidos a partir de fontes recombinantes, dificultando a avaliação dessa hipótese. Problemas semelhantes foram observados para outros alérgenos de ligação lipídica, como Bet v 112,13. Para facilitar o estudo sistemático das interações lipídica-alergênicos desenvolvemos um protocolo através do qual os alérgenos podem ser quantitativamente despojados de seus lipídios endógenos ligados e reconstituídos em forma de Apo ou carregados com ligantes específicos.
Os alérgenos são mais comumente purificados de suas fontes naturais ou recombinantes usando cromatografia de afinidade e/ou cromatografia de exclusão de tamanho. Aqui, introduzimos uma etapa adicional de purificação na forma de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) empregando uma coluna C18 de fase inversa da qual o alérgeno é elucido em um solvente orgânico semelhante aos protocolos desenvolvidos para proteínas de ligação de ácidos graxos14. A proteína resultante é então submetida a um passo de ressarcimento térmico na ausência ou presença de ácidos graxos e/ou fosfolipídios. Além de recuperar a dobra bla g 1 nativa, as temperaturas elevadas aumentam a solubilidade e a acessibilidade das cargas lipídicas, produzindo Bla g 1 na forma de Apo ou uniformemente carregada com o ligante hidrofóbico desejado. 31 Os espectros P-NMR de Bla g 1 purificados desta forma confirmaram a remoção completa de ligantes endógenos e substituição uniforme com os compostos desejados, enquanto o dicromaísmo circular confirmou a recuperação bem sucedida da dobra Bla g 1. A utilidade deste método é destacada em um trabalho recente no qual a vinculação de carga foi encontrada para aumentar a termestabilidade bla g 1 e resistência proteolítica, alterando a cinética da geração de epitope de células T com potenciais implicações para sensibilização e alergenicidade9.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito neste trabalho tem sido aplicado com sucesso para estudar sistematicamente as propriedades de ligação lipídica de Bla g 1. Isso revelou uma correlação entre ligação de carga, termestabilidade e processamento endossomal, sendo que este último foi correlacionado com a diminuição da geração de um epítope conhecido de células T com potenciais implicações para a imunogenicidade9,18. Além de Bla g 1, outros alérgenos como Pru p 3 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Tom Kirby, Scott Gabel e Dr. Robert London por sua ajuda e assistência durante este trabalho, juntamente com o Dr. Bob Petrovich e Lori Edwards pelo uso de sua instrumentação e sua ajuda na geração das construções Bla g 1 empregadas neste estudo. Agradecemos a Andrea Adams pela ajuda com a espectrometria de massa, e o Dr. Eugene DeRose pela ajuda com a instrumentação do RMN. Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramuros do NIH, Instituto Nacional de Ciências da Saúde Ambiental, Z01-ES102906 (GAM). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de Ciências da Saúde Ambiental.
Materials
| Bla g 1 Gene | Genescript | N/a | Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216 |
| Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1) | Indoor biotechnologies | N/a | Custom order |
| Agilent 1100 Series HPLC System | Agilent | G1315B, G1311A, G1322A | UV Detector, Pump, and Degasser |
| Agilent DD2 600 MHz spectrometer | Agilent | N/a | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Amicon | UFC-1008 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Benzonase | Sigma-Aldrich | E1014-5KU | |
| Broad- band 5 mm Z-gradient probe | Varian | N/a | |
| ChemStation for LC (Software) | Agilent | N/a | |
| cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850365C | |
| E. Coli BL21 DE3 Cells | New England Biolabs | C2530H | |
| Freezone 4.5 Freeze Dry System | Labconco | 7750000 | |
| Glutathione Resin | Genescript | L00206 | |
| Glutathione, Reduced | Fisher Scientific | BP25211 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | 34060 | |
| Jasco CD spectropolarimeter | Jasco | J-815 | |
| Millex Syringe Filter Unit | EMD Millipore | SLGS033SS | |
| NMRPipe (Software) | Delaglio et al. | N/a | Delaglio, F. et al. Nmrpipe – a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277–293 (1995). |
| NMRViewJ (Software) | Johnson et al. | N/a | Johnson, B. A. & Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603–614 (1994). |
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Pierce BCA Protein Assay | Sigma-Aldrich | BCA1-1KT | |
| Polaris 5 C18-A 250×10.0 mm HPLC Column | Agilent | SKU: A2000250X100 | |
| SD-200 Vacuum Pump | Varian | VP-195 | |
| Sodium Cholate Hydrate | Sigma-Aldrich | C6445 | |
| Sodium Palmitate | Sigma-Aldrich | P9767 | |
| Sodium Stearate | Sigma-Aldrich | S3381 | |
| VnmrJ (Software) | Varian | N/a |
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