הסרה והחלפה של ליגנדים אנדוגניים מחלבונים ואלרגנים הקשורים לשומנים
Summary
פרוטוקול זה מתאר את הסרת השומנים האנדוגניים מאלרגנים, ואת החלפתם בליגדות שצוינו על-ידי המשתמש באמצעות HPLC הפוך בשילוב עם חישול תרמי. 31 P-NMR ו dichroism מעגלי לאפשר אישור מהיר של הסרת ליגנד / טעינה, ואת ההתאוששות של מבנה אלרגנים מקורי.
Abstract
אלרגנים מרכזיים רבים נקשרים למולקולות הידרופוביות דמויי שומנים, כולל Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 ו- Fel d 1. ליגנדים אלה נשמרים בחוזקה ויש להם פוטנציאל להשפיע על תהליך הרגישות או באמצעות גירוי ישיר של המערכת החיסונית או שינוי התכונות הביופיזיות של החלבון האלרגני. על מנת לשלוט על משתנים אלה, טכניקות נדרשות להסרת ליגנדים מאוגדים אנדוגני, ואם יש צורך, החלפה עם שומנים של הרכב ידוע. אלרגן המקק Bla g 1 מוקף חלל הידרופובי גדול אשר קושר תערובת הטרוגנית של שומנים אנדוגני כאשר מטוהרים באמצעות טכניקות מסורתיות. כאן, אנו מתארים שיטה שדרכה שומנים אלה מוסרים באמצעות HPLC פאזה הפוכה ואחריו חישול תרמי להניב Bla g 1 בצורת Apo שלה או נטען מחדש עם תערובת מוגדרת על ידי המשתמש של חומצות שומן או מטענים פוספוליפידים. צימוד פרוטוקול זה עם מבחנים ביוכימיים מגלה כי מטעני חומצות שומן משנים באופן משמעותי את התרמו היציבות וההתנגדות הפרוטאוליטית של Bla g 1, עם השלכות במורד הזרם על קצב ייצור האפיטופים של תאי T ואלרגניות. תוצאות אלה מדגישות את החשיבות של הסרת השומנים / טעינה מחדש פרוטוקולים כגון זה המתואר בזאת בעת לימוד אלרגנים ממקורות רקומביננטיים וטבעיים כאחד. הפרוטוקול ניתן להכללה למשפחות אלרגנים אחרות כולל ליפוקלינים (Mus m 1), PR-10 (בית v 1), MD-2 (Der p 2) ו Uteroglobin (פל ד 1), מתן כלי רב ערך כדי ללמוד את התפקיד של שומנים בתגובה אלרגית.
Introduction
סקר של מסד הנתונים אלרגנים מגלה כי אלרגנים נמצאים רק 2% של כל משפחות החלבון הידוע, מציע תכונות תפקודיות וביופיזיות נפוצות לתרום אלרגניות1. מבין מאפיינים אלה, נראה כי היכולת לקשור מטעני שומנים מיוצגת יתר על המיד בקרב אלרגנים, דבר המצביע על כך שמטענים אלה עשויים להשפיע על תהליך הרגישות1. אכן, הוכח כי ברזיל אגוז אלרגן Ber e 1 דורש שיתוף ממשל עם השומנים אנדוגני שלה כדי לממש את מלוא פוטנציאל הרגישות שלה2. שומנים אלה עלולים לעורר את המערכת החיסונית ישירות כפי שמודגם על ידי אלרגנים קרדית Der p 2 ו Der p 7, שניהם חולקים הומולוגיה מבנית חזקה עם חלבונים מחייבי LPS3,4,5. בהתבסס על תצפית זו הוצע כי Derp 2 ו Der p 7 יכול לקשור שומנים חיידקיים ישירות לעורר את המערכת החיסונית המארחת באמצעות איתות TLR4 בתיווך, להקל על תהליך הרגישות5,6. זה גם אפשרי כי שומנים מאוגדים אנדוגני יכול לשנות את המאפיינים הביופיזיים של חלבונים אלרגניים עצמם. לדוגמה, היכולת של חטא 2 (חרדל) ו Ara h 1 (בוטנים) לקיים אינטראקציה עם פוספוליפידים vesicles שיפרה באופן משמעותי את עמידותם השפלה קיבה אנדוסומלית7, בעוד קשירה ליגנד אלרגן אבקה ליבנה הגדול ב ‘ v 1 שינה הן את קצב העיבוד האנדוזומלי ואת המגוון של פפטידים וכתוצאה מכך8. זה רלוונטי במיוחד לאלרגניות בהתחשב במתאם שנצפה בין יציבות, דור האפיטופים של תאי T ואלרגניות לחלבונים כמו Bet v 1 ו- Bla g 1; האחרון שבהם יהיה הנושא של עבודה זו9,10.
Bla g 1 מייצג את החבר הטיפוסי של משפחת החלבון מייג’ור אלרגן (MA), ובעל מבנה ייחודי המורכב מ -12 הליקי אלפא אמפיפתיים המקיפים חלל הידרופובי גדול באופן חריג9,11. מבנה גביש רנטגן זמין של Bla g 1 מראה צפיפות אלקטרונים בתוך חלל זה עולה בקנה אחד עם פוספוליפיד קשור או חומצת שומן ליגנדים; השערה שאושרה על ידי 31P-NMR וספקטרומטריית מסה. מטענים אלה היו הטרוגניים בטבע והרכבם היה תלוי במידה רבה במקור האלרגן, עם פרופילי שומנים שונים שנצפו עבור Bla g 1 רקומביננטי לידי ביטוי E. coli ו P. pastoris. באופן מוזר, Bla g 1 מטוהר ממקור האלרגן הטבעי שלו (frass ג’וק) הכיל בעיקר חומצות שומן בתוך אתר הכריכה שלה, עם תערובת של palmitate, oleate, ו stearate להיות מזוהה כמו ליגנדים “טבעי” שלה9,11. היכולת של Bla g 1 לשמור שומנים וחומצות שומן בעקבות צעדי טיהור מרובים מעכבת את המאמצים לחקור את החלבון בבידוד. לעומת זאת, הוצע כי פלמיאט טבעי, stearate, ו oleate ליגנדים של Bla g 1 (מעתה ואילך המכונה nMix) לשחק תפקיד מפתח הן אלרגניות שלה פונקציה ביולוגית מקורית9. עם זאת, ליגנדים אלה אינם נוכחים Bla g 1 המתקבל ממקורות רקומביננטיים, מה שמקשה להעריך השערה זו. בעיות דומות נצפו עבור אלרגנים מחייבים שומנים אחרים כגון בית v 112,13. כדי להקל על המחקר השיטתי של אינטראקציות השומנים-אלרגן פיתחנו פרוטוקול שבאמצעותו אלרגנים יכולים להיות מופשטים כמותית של השומנים שלהם מאוגדים אנדוגנית ו reconstituted או אפו טופס או טעון עם ליגנדים ספציפיים.
אלרגנים מטוהרים בדרך כלל ממקורותיהם הטבעיים או הרקומביננטיים באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה ו/או כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל. כאן, אנו מציגים שלב טיהור נוסף בצורה של כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) המעסיקה עמודת C18 הפוכה שממנה האלרגן משופע לממס אורגני בדומה לפרוטוקולים שפותחו עבור חלבונים מחייבים חומצות שומן14. החלבון המתקבל נתון לאחר מכן לשלב חישול תרמי בהיעדר או נוכחות של חומצות שומן ו/או פוספוליפידים. בנוסף לשחזור Bla g הילידי 1 לקפל, הטמפרטורות גבוהות להגדיל את המסיסות והנגישות של מטעני השומנים, מניב Bla g 1 בצורה Apo או טעון באופן אחיד עם ligand הידרופובי הרצוי. 31 ספקטרום P-NMR של Bla g 1 מטוהר באופן זה אישר את ההסרה המלאה של ליגנדים מאוגדים אנדוגני והחלפה אחידה עם התרכובות הרצויות, בעוד dichroism מעגלי אישר את ההתאוששות המוצלחת של Bla g 1 לקפל. התועלת של שיטה זו מודגשת בעבודה האחרונה שבה נמצאה כריכת מטען כדי לשפר את התרמו היציבות Bla g 1 והתנגדות פרוטאוליטית, שינוי הקינטיקה של דור האפיטופים של תאי T עם השלכות פוטנציאליות על רגישות ואלרגניות9.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר בעבודה זו יושם בהצלחה כדי לחקור באופן שיטתי את תכונות איגוד השומנים של Bla g 1. זה חשף מתאם בין מחייב מטען, תרמו יציבות, ועיבוד אנדוזומלי, האחרון שבהם היה בקורלציה עם ירידה בדור של אפיטופ T-cell ידוע עם השלכות פוטנציאליות על אימונוגניות9,18. בנוסף Bl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לד”ר טום קירבי, סקוט גבל וד”ר רוברט לונדון על עזרתם וסיועם לאורך כל העבודה, יחד עם ד”ר בוב פטרוביץ’ ולורי אדוארדס על השימוש במכשור שלהם ועל עזרתם ביצירת מבני Bla g 1 המועסקים במחקר זה. אנו מודים לאנדריאה אדמס על הסיוע בספקטרומטריית ההמונים, וד”ר יוג’ין דה-רוז על הסיוע במכשור NMR. מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר התוך-רחמי של NIH, המכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה, Z01-ES102906 (GAM). התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את השקפותיו הרשמיות של המכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה.
Materials
| Bla g 1 Gene | Genescript | N/a | Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216 |
| Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1) | Indoor biotechnologies | N/a | Custom order |
| Agilent 1100 Series HPLC System | Agilent | G1315B, G1311A, G1322A | UV Detector, Pump, and Degasser |
| Agilent DD2 600 MHz spectrometer | Agilent | N/a | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Amicon | UFC-1008 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Benzonase | Sigma-Aldrich | E1014-5KU | |
| Broad- band 5 mm Z-gradient probe | Varian | N/a | |
| ChemStation for LC (Software) | Agilent | N/a | |
| cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850365C | |
| E. Coli BL21 DE3 Cells | New England Biolabs | C2530H | |
| Freezone 4.5 Freeze Dry System | Labconco | 7750000 | |
| Glutathione Resin | Genescript | L00206 | |
| Glutathione, Reduced | Fisher Scientific | BP25211 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | 34060 | |
| Jasco CD spectropolarimeter | Jasco | J-815 | |
| Millex Syringe Filter Unit | EMD Millipore | SLGS033SS | |
| NMRPipe (Software) | Delaglio et al. | N/a | Delaglio, F. et al. Nmrpipe – a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277–293 (1995). |
| NMRViewJ (Software) | Johnson et al. | N/a | Johnson, B. A. & Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603–614 (1994). |
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Pierce BCA Protein Assay | Sigma-Aldrich | BCA1-1KT | |
| Polaris 5 C18-A 250×10.0 mm HPLC Column | Agilent | SKU: A2000250X100 | |
| SD-200 Vacuum Pump | Varian | VP-195 | |
| Sodium Cholate Hydrate | Sigma-Aldrich | C6445 | |
| Sodium Palmitate | Sigma-Aldrich | P9767 | |
| Sodium Stearate | Sigma-Aldrich | S3381 | |
| VnmrJ (Software) | Varian | N/a |
References
- Radauer, C., Bublin, M., Wagner, S., Mari, A., Breiteneder, H. Allergens are distributed into few protein families and possess a restricted number of biochemical functions. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121 (4), 847-852 (2008).
- Dearman, R. J., Alcocer, M. J. C., Kimber, I. Influence of plant lipids on immune responses in mice to the major Brazil nut allergen Ber e 1. Clinical and Experimental Allergy. 37 (4), 582-591 (2007).
- Ichikawa, S., et al. Lipopolysaccharide binding of the mite allergen Der f 2. Genes to Cells. 14 (9), 1055-1065 (2009).
- Mueller, G. A., et al. The structure of the dust mite allergen Der p 7 reveals similarities to innate immune proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (4), 909-917 (2010).
- Reginald, K., Chew, F. T. The major allergen Der p 2 is a cholesterol binding protein. Scientific Reports. 9 (1), 1556 (2019).
- Trompette, A., et al. Allergenicity resulting from functional mimicry of a Toll-like receptor complex protein. Nature. 457 (7229), 585-589 (2009).
- Angelina, A., et al. The lipid interaction capacity of Sin a 2 and Ara h 1, major mustard and peanut allergens of the cupin superfamily, endorses allergenicity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 71 (9), 1284-1294 (2016).
- Soh, W. T., et al. Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 74 (12), 2382-2393 (2019).
- Foo, A. C. Y., et al. Hydrophobic ligands influence the structure, stability, and processing of the major cockroach allergen Bla g 1. Scientific Reports. 9 (1), 18294 (2019).
- Machado, Y., et al. Fold Stability is a key factor for immunogenicity and allergenicity of the major birch pollen allergen Bet v1.0101. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1525-1534 (2016).
- Mueller, G. A., et al. The novel structure of the cockroach allergen Bla g 1 has implications for allergenicity and exposure assessment. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (6), (2013).
- Mogensen, J. E., Wimmer, R., Larsen, J. N., Spangfort, M. D., Otzen, D. E. The major birch allergen , Bet v 1 , shows affinity for a broad spectrum of physiological ligands. The Journal of Biological Chemistry. 277 (26), 23684-23692 (2002).
- Seutter von Loetzen, C., et al. Secret of the major birch pollen allergen Bet v 1: identification of the physiological ligand. Biochemical Journal. 457 (3), 379-390 (2014).
- Ibáñez-Shimabukuro, M., et al. Structure and ligand binding of As-p18, an extracellular fatty acid binding protein from the eggs of a parasitic nematode. Bioscience Reports. 39 (7), 1-16 (2019).
- Beyer, K., Klingenberg, M. ADP/ATP carrier protein from beef heart mitochondria has high amounts of tightly bound cardiolipin, as revealed by 31P nuclear magnetic resonance. Biochemistry. 24 (15), 3821-3826 (1985).
- Delaglio, F., et al. Nmrpipe – a multidimensional spectral processing system based on unix pipes. Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
- Johnson, B. A., Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. Journal of Biomolecular NMR. 4 (5), 603-614 (1994).
- Dillon, M. B. C., et al. Different Bla-g T cell antigens dominate responses in asthma versus rhinitis subjects. Clinical and Experimental Allergy. 45, 1856-1867 (2015).
- Pasquato, N., et al. Crystal structure of peach Pru p 3, the prototypic member of the family of plant non-specific lipid transfer protein pan-allergens. Journal of Molecular Biology. 356 (3), 684-694 (2006).
- Dubiela, P., et al. Impact of lipid binding on the tertiary structure and allergenic potential of Jug r 3, the non-specific lipid transfer protein from walnut. Scientific Reports. 9 (2007), 1-11 (2019).
- Abdullah, S. U., et al. Ligand binding to an allergenic lipid transfer protein enhances conformational flexibility resulting in an increase in susceptibility to gastroduodenal proteolysis. Scientific Reports. 6, 30279 (2016).
- Derewenda, U., et al. The crystal structure of a major dust mite allergen Der p 2 , and its biological implications. Journal of Molecular Biology. 318 (1), 189-197 (2002).
- Lipfert, J., Columbus, L., Chu, V. B., Lesley, S. A., Doniach, S. Size and shape of detergent micelles determined by small-angle X-ray scattering. The Journal of Physical Chemistry. B. 111 (43), 12427-12438 (2007).
- Pulsawat, P., et al. The house dust mite allergen Der p 5 binds lipid ligands and stimulates airway epithelial cells through a TLR2-dependent pathway. Clinical and Experimental Allergy. 49 (3), 378-390 (2019).
- Douliez, J. P., Michon, T., Marion, D. Steady-state tyrosine fluorescence to study the lipid-binding properties of a wheat non-specific lipid-transfer protein (nsLTP1). Biochimica et Biophysica Acta – Biomembranes. 1467 (1), 65-72 (2000).
- Ogburn, R. N., et al. Are dust mite allergens more abundant and/or more stable than other Dermatophagoides pteronyssinus proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (3), 1030-1032 (2017).
- Cabrera, A., et al. Are allergens more abundant and/or more stable than other proteins in pollens and dust. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. , 1267-1269 (2019).
- Offermann, L. R., et al. Structural and functional characterization of the hazelnut allergen Cor a 8. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (41), 9150-9158 (2015).
- Koppelman, S. J., et al. Reversible denaturation of Brazil nut 2S albumin (Ber e1) and implication of structural destabilization on digestion by pepsin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (1), 123-131 (2005).
- Smole, U., Bublin, M., Radauer, C., Ebner, C., Breiteneder, H. Mal d 2, the thaumatin-like allergen from apple, is highly resistant to gastrointestinal digestion and thermal processing. International Archives of Allergy and Immunology. 147 (4), 289-298 (2008).
- Bublin, M., et al. Effects of gastrointestinal digestion and heating on the allergenicity of the kiwi allergens Act d 1, actinidin, and Act d 2, a thaumatin-like protein. Molecular Nutrition and Food Research. 52 (10), 1130-1139 (2008).
- Griesmeier, U., et al. Physicochemical properties and thermal stability of Lep w 1, the major allergen of whiff. Molecular Nutrition and Food Research. 54 (6), 861-869 (2010).
- de Jongh, H. H. J., et al. Effect of heat treatment on the conformational stability of intact and cleaved forms of the peanut allergen Ara h 6 in relation to its IgE-binding potency. Food Chemistry. 326, 127027 (2020).
- Glasgow, B. J., Abduragimov, A. R. Ligand binding complexes in lipocalins: Underestimation of the stoichiometry parameter (n). Biochimica et Biophysica Acta – Proteins and Proteomics. 1866 (10), 1001-1007 (2018).
- Aalberse, R. C., et al. Identification of the amino-terminal fragment of Ara h 1 as a major target of the IgE-binding activity in the basic peanut protein fraction. Clinical and Experimental Allergy. 50 (3), 401-405 (2020).
- Bublin, M., Eiwegger, T., Breiteneder, H. Do lipids influence the allergic sensitization process. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 521-529 (2014).
