Eliminación Y Reemplazo De Ligandos Endógenos De Proteínas Ligadas A Lípidos Y Alérgenos

Un estudio de la base de datos de alérgenos revela que los alérgenos se encuentran en sólo el 2% de todas las familias de proteínas conocidas, lo que sugiere que las propiedades funcionales y biofísicas comunes contribuyen a la alergenicidad¹. De estas propiedades, la capacidad de unir cargas lipídicas parece estar fuertemente sobrerrepresentada entre los alérgenos, lo que sugiere que estas cargas pueden influir en el proceso de sensibilización^1. De hecho, se ha demostrado que el alérgeno de la nuez de Brasil Ber e 1 requiere co-administración con su lípido endógeno para realizar todo su potencial sensibilizante^2. Estos lípidos podrían potencialmente estimular el sistema inmune directamente como lo ilustran los alérgenos ácaros Der p 2 y Der p 7, los cuales comparten una fuerte homología estructural con las proteínas de unión a LPS^3,4,5. Sobre la base de esta observación se propuso que Derp 2 y Der p 7 podrían unirse a los lípidos bacterianos y estimular directamente el sistema inmune del huésped a través de la señalización mediada por TLR4, facilitando el proceso de sensibilización^5,6. También es posible que los lípidos endógenos unidos podrían alterar las propiedades biofísicas de las propias proteínas alergénicas. Por ejemplo, la capacidad de Sin a 2 (mostaza) y Ara h 1 (cacahuetes) para interactuar con vesículas fosfolípidas mejoró significativamente su resistencia a la degradación gástrica y endosomal^7,mientras que el ligando que se une al alérgeno principal del polen de abedul Bet v 1 alteró tanto la tasa de procesamiento endosomal como la diversidad de los péptidos resultantes^8. Esto es particularmente relevante para la alergenicidad dada la correlación que se ha observado entre la estabilidad, la generación de epítopos de células T y la alergenicidad para proteínas como Bet v 1 y Bla g 1; este último de los cuales será objeto de este trabajo^9,10.

Bla g 1 representa el miembro prototípico de la familia de proteínas de insectos alérgenos mayores (MA), y posee una estructura única compuesta por 12 hélices alfa anfipáticas que encierran una cavidad hidrofóbica anormalmente grande^9,11. La estructura cristalina de rayos X disponible de Bla g 1 muestra densidad de electrones dentro de esta cavidad consistente con ligandos de fosfolípidos o ácidos grasos unidos; una conjetura confirmada por ³¹P-RMN y espectrometría de masas. Estas cargas eran de naturaleza heterogénea y su composición dependía en gran medida de la fuente alergénica, observó diferentes perfiles lipídicos para bla g 1 recombinante expresado en E. coli y P. pastoris. Curiosamente, Bla g 1 purificado de su fuente natural de alérgenos (frass cucaracha) contenía predominantemente ácidos grasos dentro de su sitio de unión, con una mezcla de palmitato, oleato y estearato que se identifica como sus ligandos “naturales”^9,11. La capacidad de Bla g 1 para retener lípidos y ácidos grasos después de múltiples pasos de purificación dificulta los esfuerzos para estudiar la proteína de forma aislada. Por el contrario, se ha sugerido que los ligandos naturales palmitato, estearato y oleato de Bla g 1 (en adelante, nMix) juegan un papel clave tanto en su alergenicidad como en su función biológica nativa^9. Sin embargo, estos ligandos no están presentes en Bla g 1 obtenidos de fuentes recombinantes, por lo que es difícil evaluar esta hipótesis. Se han observado problemas similares para otros alérgenos de unión a lípidos como Bet v^{1 12,13}. Para facilitar el estudio sistemático de las interacciones lípido-alergénico hemos desarrollado un protocolo a través del cual los alérgenos pueden ser cuantitativamente despojados de sus lípidos endógeno unidos y reconstituidos en forma de Apo o cargados con ligandos específicos.

Los alérgenos se purifican más comúnmente de sus fuentes naturales o recombinantes mediante cromatografía de afinidad y/o cromatografía de exclusión de tamaño. Aquí, introducimos un paso de purificación adicional en forma de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) empleando una columna C18 de fase inversa a partir de la cual el alérgeno se ela en un disolvente orgánico similar a los protocolos desarrollados para proteínas de unión a ácidos grasos^14. La proteína resultante se somete entonces a un paso de recocido térmico en ausencia o presencia de ácidos grasos y/o fosfolípidos. Además de recuperar el pliegue nativo de Bla g 1, las temperaturas elevadas aumentan la solubilidad y accesibilidad de las cargas lipídicas, produciendo Bla g 1 en forma apo o uniformemente cargada con el ligando hidrofóbico deseado. ³¹ Los espectros de P-RMN de Bla g 1 purificados de esta manera confirmaron el retiro completo de ligands endógeno ligados y el reemplazo uniforme con los compuestos deseados, mientras que el dicroísmo circular confirmó la recuperación acertada del doblez de Bla g 1. La utilidad de este método se destaca en un trabajo reciente en el que se encontró que la unión a la carga mejora la termoestabilidad Bla g 1 y la resistencia proteolítica, alterando la cinética de la generación de epítopos de células T con posibles implicaciones para la sensibilización y la alergenicidad^9.