Этот протокол представляет собой 3D биомиметическую модель с сопровождающим фиброзным стромальным отсеком. Подготовлено с физиологически релевантными гидрогелями в соотношениях, имитирующих био-физические свойства стромальной внеклеточной матрицы, активного посредника клеточных взаимодействий, роста опухоли и метастазов.
Гепатоцеллюлялярная карцинома (ГКК) является основной опухолью печени, развивающейся в результате хронических заболеваний печени. Хронические заболевания печени и воспаление приводит к фиброзной среде активно поддержки и вождения гепатокарциногенез. Таким образом, значительное значение имеет понимание гепатокарциногенеза с точки зрения взаимодействия между микро-средой опухолевой стромы и опухолевыми клетками. Трехмерные (3D) модели клеточной культуры предлагаются в качестве недостающего звена между современными моделями культуры клеток in vitro 2D и моделями животных in vivo. Нашей целью было разработать новую 3D биомиметическую модель HCC с сопровождающим фиброзным стромальным отсеком и сосудами. Физиологически соответствующие гидрогели, такие как коллаген и фибриноген были включены для имитации био-физических свойств опухоли ECM. В этой модели LX2 и HepG2 клетки, встроенные в гидрогелевую матрицу, были посеяны на перевернутой трансмембранной вставке. Клетки HUVEC затем были посеяны на противоположной стороне мембраны. Были подготовлены три рецептуры, состоящие из ЭКМ-гидрогели, встроенных в клетки, и био-физические свойства были определены реологией. Жизнеспособность клеток определялась анализом жизнеспособности клеток в течение 21 дня. Эффект химиотерапевтического препарата доксорубицин оценивался как в 2D-ко-культуре, так и в нашей 3D-модели в течение 72ч. Результаты реологии показывают, что био-физические свойства фиброзной, цирротической и HCC печени могут быть успешно имитирован. В целом результаты показывают, что эта 3D-модель более репрезентативна для ситуации in vivo по сравнению с традиционными 2D культурами. Наша 3D модель опухоли показала снижение реакции на химиотерапию, имитируя лекарственная устойчивость, обычно наблюдается у пациентов HCC.
Гепатоцеллюлярной карциномы (HCC) составляет 90% всех первичных ракапечени 1,2. С 810000 смертей и 854000 новых случаев ежегодно сообщается он в настоящее время занимает пятое место наиболее распространенных раковых заболеваний во всем мире с одним из самых высоких показателейсмертности 1. Развитие HCC в основном связано с воспалением, связанным с хроническими заболеваниями печени, а именно, вирусный гепатит, хроническое чрезмерное потребление алкоголя, метаболический синдром,ожирение и диабет 1,3,4. Воспаление, связанное с этими патологическими состояниями приводит к травме гепатоцитов и секреции различных цитокинов, которые активируют и вербуют печеночные клетки стеллата и воспалительные клетки, чтобы инициироватьфиброз 5. Клетки печеночные стеллат известны своей ключевой ролью в инициировании, прогрессировании и регрессии печеночным фиброзом. При активации они дифференцируются в миофибробласт, как клетки с контрактильными, провоспалительными и профибриногеннымисвойствами 6,7,8. В результате фиброз, в свою очередь, вызывает дисрегуляцию внеклеточной матрицы ремоделирования ферментной активности,создавая среду, характеризующуюсяобщей повышенной жесткостью сопровождается секрецией факторов роста, что еще больше способствует патогенезу HCC 9,10. Именно эта непрерывная патогенная обратная связь между гепатоцитами и стромальной средой, которая подпитывает начало рака, эпителиальный мезенхимальные переходы (ЭМТ), ангиогенез, метастатический потенциал, и измененнаяреакция препарата 11,12,13. Поэтому понимание гепатокарциногенеза с точки зрения взаимодействия опухоли и микро-среды опухоли имеет большое значение не только с точки зрения механистического, но и с точки зрения лечения.
Двухмерные (2D) модели культуры клеток в пробирке в основном используются 80% биологов раковых клеток14. Однако эти модели не являются репрезентативными для истинной микро-среды опухоли, которая влияет нахимиотерапевтические реакции 14,15,16. В настоящее время 96% химиотерапевтических препаратов терпят неудачу во время клиническихиспытаний 14. Такая высокая заболеваемость в скорости истощения наркотиков может быть связано с тем, что имеющиеся в пробирке предпоказ модели не в полной мере представляют наше текущее понимание и понимание сложности HCC и микрооквидения16. И наоборот in vivo животных моделей, присутствующих с ослабленной иммунной системой и расхождения во взаимодействии между опухолью и микропронимки посравнению с людьми 16,17. В среднем только 8% результатов, полученных в результате исследований на животных, могут быть надежно переведены из доклиническихв клинические условия 16,17. Поэтому очевидно, что оценка HCC требует разработки платформы in vitro, которая эффективно резюмирует сложность не только опухоли, но и микроокноронии. Платформы будут дополнять имеющиеся в настоящее время в пробирке доклинических моделей скрининга и уменьшить количество исследованийна животных в будущем 7,14.
Одной из таких платформ являются передовые трехмерные (3D) модели клеточной культуры. Множество из этих передовых 3D-моделей для изучения HCC появились в течение последнего десятилетия и различные обзоры были опубликованы. Доступные 3D-модели для изучения HCC включают многоклеточные сфероиды, органоиды, эшафот-модели, гидрогели, микрофлюиду и биопечать. Из них многоклеточные сфероиды являются одной из самых известных моделей, используемых в исследовании развития опухоли. Сфероиды являются недорогой моделью с низкой технической сложностью и в то же время эффективно имитируя архитектуру опухоли in vivo18,19,20. Многоклеточные сфероиды внесли свой вклад в огромное количество информации о HCC17,21,22. Тем не менее, стандартизированное время культуры не хватает, как многоклеточные сфероиды хранятся в культуре от 7 до 48 дней. Значительное значение имеет увеличение времени в области культуры. Эйленбергер обнаружил, что различия в сфероидном возрасте глубоко влияет на Sorafenib (ингибитор киназы, используемый для лечения рака печени) диффузивностьи токсичность 23. В то время как Wrzesinski и Фей обнаружили, что 3D сфероиды гепатоцитов требуют 18 дней, чтобы восстановить ключевые физиологические функции печени после трипсинизации и продолжает проявлять стабильную функциональность в течение 24 дней послеэтого восстановления 24,25.
Некоторые из более продвинутых 3D моделей HCC включает в себя использование человека decellularized печени леса и био-печатных лесов. Mazza и его коллеги создали естественный 3D эшафот для моделирования HCC с использованием децеллюляризованной печени человека, не подходящей длятрансплантации 26. Эти природные леса могут быть успешно заселены в течение 21 дней с совместной культуры печеночные stellate и гепатобластома клеток, сохраняя при этом выражение ключевых внеклеточных компонентов матрицы, таких как коллаген типа I, III, IV и фибронектин. Помимо моделирования заболеваний, эта модель также предлагает преимущество функциональной трансплантации органов и доклинических наркотиков и токсичности скрининга26. С достижениями в 3D био-печати, 3D внеклеточные матричные леса теперь также могут быть био-печати. Ма и его коллеги, био-печатные внеклеточные матричные леса с переменными механическими свойствами и биомиметическая микроархитектура с использованием гидрогелевого инженера из децеллюлярной внеклеточнойматрицы 27. Несомненно, все это отличные 3D модели HCC. Однако отсутствие человеческой печени и затраты, связанные с приобретением необходимого оборудования и материалов, ставит эти модели в невыгодное положение. Кроме того, все эти методы технически продвинуты, требующие обширной подготовки, которая может быть недоступна для всех исследователей.
Основываясь на сложности HCC и имеющихся в настоящее время 3D-моделей, мы постарались разработать всеохватывающую 3D модель HCC. Мы стремились к модели, способной резюмировать как премалигнант, так и микроокноронность опухоли путем включения регулируемых значений жесткости гидрогеля. Кроме того, мы также включили гепатоцеллюлярные и строма связанных клеточных линий, которые играют ключевую роль в патогенеза HCC. К ним относятся эндотелиальные клетки, печеночные клетки стеллата и злокачественные гепатоциты, выращенные в микроокноронии, состоящей из физиологически релевантных гидрогелей. С выбранными гидрогелями, коллагеном типа I и фибриногеном, включенными в соотношения, сопоставимые с био-физическими изменениями, замеченными в жесткости печени во время инициации и прогрессирования HCC. Кроме того, мы стремились к модели, которая могла бы храниться в культуре в течение длительного периода времени. Мы предусмотрели модульную, экономически эффективную модель, которая может быть оснащена базовым оборудованием, минимальной подготовкой и опытом, а также легкодоступными материалами.
Этот протокол описывает разработку метода создания биомиметического модели для HCC. Установлен четкий рабочий процесс и определены критические шаги. Эти критические шаги включают в себя, подготовка фибриногена фондовый раствор, покрытие вставки коллагеном и посева клеток, вложенных в гидрогель. При приготовлении раствора фибриногена важно добавлять фибриноген небольшими шагами при более высоких концентрациях. Это не только сократит время, необходимое для фибриногена, чтобы раствориться, но также предотвратит фибриноген от гелеобразования непоследовательно и преждевременно, как по видно на рисунке 11. Подготовка фибриногенного геля занимает значительное количество времени, и это может повлиять на общий экспериментальный успех. Результаты показывают, что как только фибриноген гель начинает гель непоследовательно лучше отказаться от него. Вставки должны быть покрыты коллагеном, промыть PBS и высушить в ламинарном капюшоне потока до посева клеток, встроенных в гидрогели. Неспособность обеспечить сухую вставку приведет к тому, что гидрогель прольется по краям вставки, что приведет к неравномерности геля. Неравномерность геля в конечном итоге повлияет на результаты, где диффузия является фактором.
Рисунок 11: Подготовка фибриногенного геля для фибриногенных/коллагеновых гидрогелевых составов. (A) Фибриноген гель раствор, который сформировал сгустки и начал гель преждевременно с неразрешено fibrinogen прилипания к трубке. (B)Фибриноген гель растворился полностью, раствор ясен и немного вязким. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рекомендуется работать как можно быстрее при посеве подвески гидрогелевых клеток на вставки, так как компонент фибриногена начнет пересекаться с добавлением тромбина. Подготовка меньших рабочих объемов в то время, когда работа с гелем подвески в более высоких концентрациях, чтобы предотвратить гель от перекрестного во время посева. Последний будет иметь влияние на распределение и количество геля посеяны на каждой хорошо. Порядок добавления компонентов имеет решающее значение, в этом протоколе мы предоставили обтекаемый рабочий процесс, чтобы предотвратить преждевременное скрещивание гелей. В связи с вязкостью гидрогеля гель подвески, работающих с разрезом пипетки наконечник рекомендуется во время смешивания и измерения. При смешивании подвески убедитесь, что это делается быстро и равномерно для создания однородной подвески. Неравномерное смешивание приведет к неоднородный гель, который негативно повлияет на результаты, см. Рисунок 12.
Рисунок 12: Коллаген / фибриноген гели посеяны на 12 пластин хорошо. Все гели посеяны в объеме 200 л, содержащий коллаген 2 мг/мл и 20 мг/мл фибриногена с 2,0 х 106 клеток/мл. (A)Гидрогель гель с неоднородной консистенцией, видимым неравномерным распределением гидрогелей. (B)Гидрогели однородно смешиваются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
После оптимизации протокола была проведена оценка модели для определения био-физических свойств моделей. Данные реологии показали, что наша модель, состоящая из физиологически релевантных внеклеточных компонентов матрицы, а именно коллагена типа I и фибриногена, смогла имитировать био-физические свойства фиброзной, цирротической и HCC печени28,29,30,31,32. Повторение жесткости печени в 3D-моделях для HCC имеет большое значение и часто упускается из виду во время разработки модели. Повышенная жесткость печени связана с химиотерапевтической устойчивостью, пролиферацию, миграцию и спячку внутри HCC38. В то время как активация печеночные клетки stellate в HCC связано с увеличением внеклеточной жесткости матрицы, с несколькими сигнальными путями, связанными с этими печеночными клетками stellate, показывающими механочувствительность39.
Включение стромы связанных клеток, таких как печеночные клетки стеллата и эндотелиальных клеток в развитие 3D-моделей для HCC становится все более актуальным. Исследования показывают, что многоклеточные сфероиды, состоящие из печеночных stellate и HCC клеток привело к увеличению химиотерапевтического сопротивления и инвазивной миграции, имитируя появление опухоли HCC in vivo, по сравнению с моделью мышей PXT и образцами тканей человека HCC17. Аналогичное исследование, проведенное Jung et al., 2017, показало, что многоклеточный сфероид, состоящий из гепатоцеллюлярной карциномы (Huh-7) и эндотелиальных (HUVEC) клеток, способствует васкуляризации иагрессивности 22. Эти сфероиды показали жизнеспособность при значительно более высоких концентрациях доксорубицина и сорафениба по сравнению с монокультурными сфероидамиHuh-7 22. Оценка жизнеспособности нашей модели и реакции на доксорубицин, с значениями жесткости, соответствующими значениям HCC и включением стромы связанных клеток (LX2 и HUVEC), показала аналогичное снижение в ответ на химиотерапию по сравнению с 2D моделью совместной культуры. Таким образом, эффективно имитируя лекарственная устойчивость обычно наблюдается у пациентов и других 3D моделей HCC.
Поскольку это модульная система, модель может быть укреплена добавлением других внеклеточных матричных компонентов, а именно ламинина и гиалуроновой кислоты. Кроме того, нынешние гидрогели, используемые в этой модели, могут быть заменены синтетическими гидрогелями, такими как альгинат натрия или хитозан. Дальнейшим изменением нынешней модели может быть замена клеточных линий первичными клеточными культурами для создания еще более физиологически релевантной модели или с использованием комбинаций других опухолевых и стромальных клеточных линий.
Таким образом, мы успешно разработали 3D-модель с настраиваемыми био-физическими свойствами для изучения опухолевых взаимодействий в HCC. Мы обнаружили, что наша модель более репрезентативна для ситуации in vivo по сравнению с традиционными 2D культурами в ответ на доксорубицин. Тем не менее, многое еще предстоит сделать, мы надеемся широко охарактеризовать эту модель и изучить модель в качестве возможной метастатической платформы, чтобы ответить на более сложные и насущные вопросы, которые остаются в исследовании HCC.
The authors have nothing to disclose.
Это исследование финансировалось за счет грантов, полученных от Шведского онкологического фонда (Cancerfonden, CAN2017/518), Шведского общества медицинских исследований (SSMF, S17-0092), фонда O.E. och Edla Johanssons и фонда Ольги Янссонс. Эти источники финансирования не были задействованы в разработке исследования; сбор, анализ и интерпретация данных; написание доклада; и в решении представить статью для публикации. 3D-печать специально разработанных спейсеров, используемых в этом протоколе, была выполнена в U-PRINT: 3D-печать Университета Уппсалы в Дисциплинарном домене медицины и фармации, U-PRINT@mcb.uu.se. Мы хотели бы поблагодарить Пола О’Каллагана за его ценный вклад в наш проект.
AlamarBlue (Resazurin sodium salt) | Sigma | 211-500 | Prepare according to manufacturesr recommendations |
Antibiotic Antimycotic Solution (100×), Stabilized | Sigma | A5955-100ML | |
Aprotinin Protease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 78432 | |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C1016-2.5KG | Anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0% |
CO2 Incubator | Kebo Biomed Sweden | ||
Corning Black, clear flat bottom 96-well plate | Sigma | CLS3904-100EA | |
Corning HTS Transwell-24 well permeable supports | Sigma | CLS3396-2EA | HTS Transwell-24 units w/ 0.4 μm pore polycarbonate membrane and 6.5 mm inserts, TC-treated, sterile, 2/cs |
Discovery Hybrid Rheometer 2 | TA instruments, Sollentuna, Sweden | ||
DMEM, high glucose, GlutaMAX supplement (LX2 and HepG2 cells) | Thermo Fisher Scientific | 61965059 | Supplemented with 10% v/v FBS and 1% v/v antibiotic antimycotic solution |
Endothelial Cell Growth Medium (500 ml) (HUVEC) | Cell Applications, Inc | 211-500 | |
Fetal Bovine Serum, qualified, One Shot format, New Zealand | Thermo Fisher Scientific | A3160902 | |
Fibrinogen type I-S from bovine plasma | Sigma | F8630-10G | |
FLUOstar Omega plate reader | BMG Labtech | ||
Hanks' balanced salt solution | Sigma | H9394-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride and magnesium sulfate |
Labogene scanspeed 416 centrifuge | Labogene, Sweden | ||
Laminar flow hood | Kebo Biomed Sweden | ||
Mettler Toledo AG245 Analytical Balance | Mettler Toledo | ||
Nikon TMS Light microscope | Nikon, Japan | ||
Phosphate buffered saline tablet | Sigma | P4417-100TAB | Prepare according to manufacturers recommendation |
Rat tail Collagen Type I 5 mg/mL | Ibidi | 50201 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653-1KG | |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Merck | B619298 | |
TC20 Automated cell counter | BioRad | ||
TC20 cell counter counting slides | BioRad | ||
Thrombin from bovine plasma | Sigma | T9549 | Powder, suitable for cell culture, ≥1,500 NIH units/mg protein (E1%/280 = 19.5) |
Trypsin (2.5%) 10x | Thermo Fisher Scientific | Dilute to 1x in PBS | |
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma | T6414-100ML | Solution, sterile-filtered |