A Biomimetic Model for Liver Cancer to Study Tumor-Stroma Interactions in a 3D Environment with Tunable Bio-Physical Properties

Carlemi Calitz; Nata&#353;a Pavlovi&#263;; Jenny Rosenquist; Claudia Zagami; Ayan Samanta; Femke Heindryckx

doi:10.3791/61606

JoVE Journal > Cancer Research

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Cancer Research

نموذج حيوي لسرطان الكبد لدراسة التفاعلات الورم ستروما في بيئة 3D مع خصائص بيو فيزيائية قابلة للتوابل

Published: August 07, 2020

doi:

10.3791/61606

Carlemi Calitz¹, Nataša Pavlović¹, Jenny Rosenquist², Claudia Zagami¹, Ayan Samanta², Femke Heindryckx¹

¹Department of Medical Cell Biology,Uppsala University, ²Polymer Chemistry, Department of Chemistry-Ångström Laboratory,Uppsala University

Summary

يقدم هذا البروتوكول نموذجًا حيويًا ثلاثي الأبعاد مع مقصورة السترومال الليفية المصاحبة. أعدت مع الهيدروجيل ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية في نسب تحاكي الخصائص الحيوية الفيزيائية للمصفوفة خارج الخلية stromal، وسيط نشط للتفاعلات الخلوية، ونمو الورم والنقائل.

Abstract

سرطان الكبد (HCC) هو ورم الكبد الأساسي النامية في أعقاب مرض الكبد المزمن. أمراض الكبد المزمنة والتهاب يؤدي إلى بيئة ليفية دعم بنشاط وقيادة خلايا الكبد. نظرة ثاقبة في تكوين الكبد من حيث التفاعل بين الورم stroma البيئة الدقيقة والخلايا السرطانية وبالتالي من أهمية كبيرة. ويقترح ثلاثي الأبعاد (3D) نماذج ثقافة الخلية كحلقة مفقودة بين الحالية في المختبر 2D نماذج الخلية والثقافة في نماذج الحيوانات في الجسم الحي. كان هدفنا هو تصميم نموذج HCC حيوي ثلاثي الأبعاد ثلاثي الأبعاد مع مقصورة السترومال الليفية المصاحبة والأوعية الدموية. تم دمج الهيدروجيل ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية مثل الكولاجين والفيبرينوجين لمحاكاة الخصائص الحيوية الفيزيائية للورم ECM. في هذا النموذج LX2 وHpG2 الخلايا جزءا لا يتجزأ من مصفوفة هيدروجيل كانت مبذرة على إدراج عبر مقلوب. ثم تم زرع خلايا HUVEC على الجانب الآخر من الغشاء. تم إعداد ثلاث تركيبات تتكون من الهيدروجين ECM-hydrogels جزءا لا يتجزأ من الخلايا وتم تحديد الخصائص الحيوية الفيزيائية من قبل الريولوجيا. تم تحديد صلاحية الخلية من خلال فحص صلاحية الخلية على مدى 21 يومًا. تم تقييم تأثير الدواء العلاج الكيميائي دوكسيوروبيسين في كل من الثقافة المشتركة 2D ونموذجنا 3D لفترة من 72h. تظهر نتائج الريولوجيا أن الخصائص الحيوية الفيزيائية للكبد الليفي والتليفي والكبد الكبدي الليفي يمكن محاكاته بنجاح. عموما، تشير النتائج إلى أن هذا النموذج 3D هو أكثر تمثيلا للحالة في الجسم الحي بالمقارنة مع الثقافات التقليدية 2D. أظهر نموذج الورم ثلاثي الأبعاد لدينا استجابة أقل للعلاج الكيميائي ، مما يحاكي مقاومة الأدوية التي ينظر إليها عادة في مرضى HCC.

Introduction

سرطان الكبد (HCC) يتكون من 90٪ من جميع سرطانات الكبد الأولية¹^,². مع 810,000 حالة وفاة و 854,000 حالة جديدة يتم الإبلاغ عنها سنوياً، يتم تصنيفها حالياً كخامس أكثر أنواع السرطان شيوعاً في جميع أنحاء العالم مع واحدة من أعلى حالات الوفيات¹. ويعزى تطور HCC في الغالب إلى التهاب المرتبطة بأمراض الكبد المزمنة وهي التهاب الكبد الفيروسي، وتناول الكحول المفرط المزمن، متلازمة الأيض، والسمنة والسكري¹^،³^،⁴. الالتهاب المصاحب لهذه الحالات المرضية يؤدي إلى إصابة الكبد وإفراز السيتوكينات المختلفة التي تنشط وتجند خلايا نجمية كبدية وخلايا التهابية لبدء التليف⁵. خلايا نجمية الكبد معروفة لدورها الرئيسي في بدء, التقدم, وتراجع التليف الكبدي. عند تفعيل أنها تفرق في myofibroblast مثل الخلايا مع انقبال, الموالية للالتهابات والخصائص الموالية لفيترينوينيك⁶^,⁷^,⁸. التليف الناتج بدوره يسبب خلل في تنظيم مصفوفة خارج الخلية إعادة تشكيل نشاط الانزيم، وخلق بيئة تتميز زيادة تصلب العام يرافقه إفراز عوامل النمو، مما يساهم كذلك في التسبب HCC⁹^،¹⁰. هو هذا التغذية المرتدة المسببة للأمراض المستمرة حلقة بين الكبد والبيئة stromal، الذي يغذي بدء السرطان، الظهارية إلى التحولات mesenchymal (EMT)، تولد الأوعية الدموية، إمكانية النقيلي، والاستجابة المخدرات غيرت¹¹^،¹²^،¹³. لذا فإن التبصر في تكوين خلايا الكبد من حيث التفاعل بين الورم وبيئة الورم الصغرى هو، بالتالي، أهمية كبيرة ليس فقط من المكنانية ولكن أيضا من منظور العلاج.

ثنائية الأبعاد (2D) في الخلايا في المختبر تستخدم نماذج ثقافة 80٪ من علماء الأحياء الخلايا^{السرطانية 14}. ومع ذلك، هذه النماذج لا تمثل البيئة الورم الصغير الحقيقي، الذي يؤثر على الردود العلاج الكيميائي¹⁴^،¹⁵^،¹⁶. حاليا 96٪ من الأدوية العلاجية الكيميائية تفشل خلال التجارب السريرية¹⁴. ويمكن أن يعزى هذا معدل الإصابة العالية في معدلات التناقص إلى حقيقة أن النماذج المتاحة في المختبر قبل الفحص لا تمثل تماما رؤيتنا الحالية وفهمنا لتعقيد HCC و البيئة الدقيقة¹⁶. على العكس من ذلك في نماذج الحيوانات الحية الحالية مع أجهزة المناعة للخطر والتناقضات في التفاعلات بين الورم و البيئة الدقيقة بالمقارنة مع البشر¹⁶^,¹⁷. في المتوسط فقط 8٪ من النتائج التي تم الحصول عليها من الدراسات الحيوانية يمكن ترجمتها بشكل موثوق من ما قبل السريرية إلى الإعداد السريري¹⁶^,¹⁷. ولذلك ، فمن الواضح أن تقييم HCC يتطلب تطوير منصة في المختبر الذي يلخص بشكل فعال تعقيد ليس فقط الورم ولكن أيضا البيئة الدقيقة. وسوف تكمل المنصات المتاحة حاليا في المختبر قبل السريرية نماذج الفحص والحد من كمية الدراسات الحيوانية في المستقبل⁷^,¹⁴.

واحدة من هذه المنصات هي متقدمة ثلاثية الأبعاد (3D) نماذج ثقافة الخلية. وقد ظهرت العديد من هذه النماذج المتقدمة 3D لدراسة HCC على مدى العقد الماضي، وقد نشرت العديد من الاستعراضات. وتشمل النماذج 3D المتاحة لدراسة HCC spheroids متعددة الخلايا، organoids، نماذج القائمة على السقالة، الهيدروجيل، microfluidics، والطباعة الحيوية. من هذه، النماذج متعددة الخلايا هي واحدة من النماذج الأكثر شهرة المستخدمة في دراسة تطور الورم. Spheroids هي نموذج غير مكلفة مع صعوبة تقنية منخفضة في الوقت نفسه محاكاة فعالة في العمارة الورم vivo¹⁸^,¹⁹^,²⁰. وقد ساهمت اللولبيات متعددة الخلايا في ثروة من المعلومات على HCC¹⁷^،²¹^،²². ومع ذلك، لا يوجد وقت ثقافة موحدة كما يتم الاحتفاظ spheroids متعددة الخلايا في ثقافة بين 7 إلى 48 يوما. زيادة وقت الثقافة له أهمية كبيرة. إيجينبرغر وجدت أن الاختلافات في العمر الرفوئي يؤثر بعمق Sorafenib (مثبط كيناز المستخدمة لعلاج سرطانات الكبد) الانتشارية والسمية²³. في حين وجد Wrzesinski و Fey أن 3D الكبد spheroids تتطلب 18 يوما لإعادة إنشاء وظائف الكبد الفسيولوجية الرئيسية بعد التربسينية ويستمر في عرض وظائف مستقرة لمدة تصل إلى 24 يوما بعد هذا الانتعاش²⁴^,²⁵.

بعض من أكثر تقدما 3D HCC نماذج تشمل استخدام الإنسان سقالات الكبد decellularized والسقالات المطبوعة بيولوجيا. Mazza وزملاؤه خلق سقالة 3D الطبيعية لHCC النمذجة باستخدام الكبد البشري decellularized غير مناسبة لزراعة²⁶. يمكن إعادة ملء هذه السقالات الطبيعية بنجاح لمدة 21 يومًا مع ثقافة المشاركة في خلايا النجم الكبدي وخلايا الورم الكبدي ، مع الحفاظ على التعبير عن مكونات المصفوفة الرئيسية خارج الخلية مثل نوع الكولاجين الأول والثالث والرابع والليفي. بخلاف النمذجة المرض، وهذا النموذج كما يقدم ميزة زرع الأعضاء الوظيفية و ما قبل السريرية المخدرات وفحص السمية²⁶. مع التقدم في الطباعة الحيوية 3D، 3D مصفوفة خارج الخلية السقالات يمكن الآن أيضا أن تكون مطبوعة بيولوجيا. Ma وزملاؤه، سقالات مصفوفة خارج الخلية المطبوعة بيولوجيا مع خصائص ميكانيكية متغيرة وهندسة microarchitectic الحيوية باستخدام مهندس hydrogels من مصفوفة خارج الخلية decellularized²⁷. مما لا شك فيه أن هذه هي كل نماذج ممتازة 3D HCC. ومع ذلك، فإن عدم توافر الكبد البشري والتكلفة التي ينطوي عليها الحصول على المعدات والمواد اللازمة يضع هذه النماذج في وضع غير مؤات. بالإضافة إلى ذلك، فإن هذه الطرق كلها متقدمة من الناحية الفنية وتتطلب تدريباً مكثفاً قد لا يكون متاحاً بسهولة لجميع الباحثين.

بناء على تعقيد HCC والنماذج 3D المتاحة حاليا، ونحن نسعى لتطوير نموذج HCC 3D شاملة. ونحن نهدف لنموذج قادر على تلخيص كل من premalignant والورم microenonment من خلال دمج قيم صلابة هيدروجيل قابل للتعديل. وعلاوة على ذلك، ونحن أيضا شملت خلايا الكبد و stroma المرتبطة خطوط الخلية، التي تلعب دورا رئيسيا في التسبب في HCC. وتشمل هذه الخلايا البطانية، وخلايا ممتازة الكبد وخلايا الكبد الخبيثة، التي تزرع في بيئة صغيرة تتألف من الهيدروجيل ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. مع الهيدروجيلات المختارة، نوع الكولاجين الأول والفيبرينوجين، أدرجت في نسب مماثلة للتغيرات الحيوية المادية التي شوهدت في تصلب الكبد أثناء بدء وتطور HCC. بالإضافة إلى ذلك، نهدف إلى نموذج يمكن الاحتفاظ به في الثقافة لفترة زمنية طويلة. لقد تصورنا نموذجًا نموذجيًا وفعالًا من حيث التكلفة يمكن إعداده مع المعدات الأساسية والحد الأدنى من التدريب والخبرة والمواد المتاحة بسهولة.

Protocol

الشكل 1: تصوير رسومي لإنشاء نموذج HCC 3D الحيوي من أجل التهكمي، يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. ملاحظة: يتم تعيين سير العمل العام لهذا البروتوكول في الرسوم التوضيحية الشكل 1 1. إعداد محلول الأسهم الفيبرينوجين إعداد كلوريد الكالسيوم 1 م (CaCl2) محلول الأسهم, عن طريق وزنها 2.21 غرام CaCl2 وإضافته إلى 20 مل ماء مقطر (dH2O). يمكن تخزين محلول الأسهم في درجة حرارة الغرفة (RT). إعداد 20 مل aprotinin حل الأسهم (1218.75 KIU / مل) عن طريق وزنها 5 ملغ من aprotinin وإضافته إلى 20 مل dH2O. Aliquot حل الأسهم في 1 مل aliquots وتخزينها في -20 درجة مئوية. إعداد 10 مل من 80 ملغ / مل محلول الأسهم الفيبرينوجين. في أنبوب 50 مل إضافة 7.849 مل الفوسفات العازلة المالحة (PBS)، 2.051 مل aprotinin الأسهم (1218.75 KIU / مل) لتركيز aprotinin النهائي من 250 KIU / مل و 100 μL CaCl2 (1M) لتركيز CaClالنهائي 2 من 10m. تزن 800 ملغ من الفيبرينوجين. وزن 200 ملغ كلوريد الصوديوم (NaCl) لمحلول الأسهم لاحتواء 2٪ ث / الخامس NaCl. إضافة الفيبرينوجين و NaCl في زيادات إلى أنبوب 50 مل تحتوي على برنامج تلفزيوني، aprotinin وCaCl2. لا يحرك أو يهز بقوة لأن هذا سيؤدي إلى التبلور الفيبرينوجين وكتل تشكيل في الحل. ضع أنبوب 50 مل من محلول الأسهم الفيبرينوجين أفقيا على شاكر ويهز في إعداد منخفض من 300 دورة في الدقيقة. بمجرد حل الحل، قم بتصفيتها باستخدام فلتر حقنة 0.22 ميكرومتر أو مرشح علوي للزجاجة اعتمادًا على مستوى الصوت. الأهم من ذلك، لا الأوتوكلاف محلول الفيبرينوجين لأن هذا سوف يدمر الفيبرينوجين.ملاحظة: يمكن أن يستغرق هذا الجزء من البروتوكول ما بين 2 إلى 5 ح اعتمادا على كمية من حل الأسهم، وهذه المرة ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار أثناء الإعداد التجريبية. 2. إدراج الطلاء مع الكولاجين قبل بذر الهيدروجيل على إدراج في غطاء تدفق لارينار أو غطاء لثقافة الأنسجة، وذلك باستخدام ملاقط معقمة، وإزالة إدراج من لوحة ووضع مقلوب على غطاء من لوحة. إعداد 100 مل من 20 مل الجليدية حمض حامض الخل المحلول حل بإضافة 115 ميكرولتر من حمض الخليك الجليدي إلى 25 مل من dH2O والتكيف مع حجم النهائي من 100 مل مع dH2O. تصفية الحل باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر. يمكن تخزين حل الأسهم في RT. إعداد 2 مل من 100 ميكروغرام / مل حل الكولاجين من 5 ملغ / مل حل الكولاجين عن طريق إضافة 40 ميكرولتر من 5 ملغ / مل حل الكولاجين إلى 1.960 مل من 20 mM glacial حمض حامض الخل الحل المعدة في 2.2. معطف إدراج مع 100 ميكروغرام / مل حل الكولاجين أعدت في 2.3 عن طريق الأنابيب 100 μL من الحل على كل إدراج. واسمحوا إدراج الهواء الجاف داخل غطاء محرك السيارة تدفق لارينار أو غطاء غطاء لثقافة الأنسجة لمدة 2 إلى 3 ساعات. بمجرد إدراج قد جفت غسل كل إدراج 3x مع برنامج تلفزيوني. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني إلى كل بئر من لوحة 12 جيدا، ووضع إدراج مع طلاء الكولاجين التي تواجه أسفل في الآبار، وإزالة برنامج تلفزيوني من البئر وتكرار الإجراء. واسمحوا إدراج الهواء الجاف داخل غطاء محرك تدفق لارينار 1 إلى 2 ساعة.تنبيه: حمض الخليك هو سام للخلايا وينبغي غسلها إدراج جيدا مع برنامج تلفزيوني. إضافة 3D مخصص المطبوعة على إدراج، وهذا سيكون من الضروري مرة واحدة المواد الهلامية تتدلى من إدراج لمنعهم من لمس بئر أسفل من لوحة (الشكل 2). الشكل 2: مخصص 3D المطبوعة الفضاء الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. تغطية إدراج مقلوب مع الجزء السفلي من لوحة ومكان في الحاضنة حتى يتم تضمين الخلايا في الهيدروجيل وجاهزة لتكون مبذرة. 3. خلايا البذر جزءا لا يتجزأ من الهيدروجيلس على إدراج ملاحظة: يقدم الجدول 1 وصفاً لـ 3 تركيبات ذات تركيزات مختلفة من الفيبرينوجين التي سيتم إعدادها. صياغة واحدة يتوافق مع الكبد خلال بداية التليف, اثنين تليف الكبد وثلاثة HCC, تم تحديد قيم صلابة لكل من هذه التركيبات مع الريولوجيا خلال التحسين بروتوكول. صياغه تركيز الفيبرينوجين النهائي (ملغ / مل) تركيز الكولاجين النهائي (ملغ / مل) الخلايا (LX2 + HepG2 ثقافة 1:1) مرحلة من الكبد أدب قيم تصلب الكبد (كيلو باسكال) نموذج صلابة قيمة من علم الروماتيزم (كيلو باسكال) صياغه فيبرينوجين لإضافة (مل) الكولاجين لإضافة (مل) 10 ٪ DMEM (مل) خثارة (μL) مرجعs 1 10 2 2 × 106 خلايا / مل التليف ≥2 3 1 1 0.8 0.2 4 28; 29; 30 2 30 2 2 × 106 خلايا / مل تليف الكبد 6 2 0.75 0.8 0.45 3 3 40 2 2 × 106 خلايا / مل Hcc ≥10 10 3 0.25 0.8 0.95 1 28; 31; 32 الجدول 1: وصف تركيبات خلايا البذر المدمجة في الهيدروجيل على المواد المُدرجات إعداد 1 M محلول مخزون هيدروكسيد الصوديوم عن طريق إضافة 3.99 غرام من NaOH إلى 100 مل من dH2O. ويمكن بعد ذلك تصفية الحل باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر. تخزين حل الأسهم في RT. ضع الكولاجين 5 ملغ/مل و10 مل من 1 M NaOH على الجليد. سخني 50 مل بي بي إس، 15 مل التربسين، 70 مل 10٪ DMEM، و fibrinogen حل الأسهم، أعدت في القسم 1، إلى 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في حمام مائي. إعداد تعليق الخلية. غسل الخلايا النجمية الكبدية (LX2) وسرطان الكبد (HepG2) الخلايا في T175 قارورة الثقافة مرتين مع 10 مل من برنامج تلفزيوني. الخلايا التربسينيزي مع 6 مل التربسين لمدة 4 دقائق في 37 درجة مئوية. إلغاء تنشيط التربسين مع 6 مل من 10٪ DMEM. جمع تعليق الخلية في أنبوب 15 مل والطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 300 × ز. بعد الطرد المركزي، pirate supernatant و resuspend كل خط الخلية في 5 مل من 10٪ DMEM. عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا التلقائي: أضف 10 ميكرولتر من كل تعليق خلية إلى شريحة غرفة الجرد وأدخل الشريحة في عداد الخلايا. يتم عرض عدد الخلايا كخليات/مل. تخفيف الخلايا من كل خط خلية إلى 1 × 106 خلايا لكل مل باستخدام عدد الخلايا في الخطوة 3.4.6 إلى أنابيب 15 مل ملحوظ بوضوح. أجهزة الطرد المركزي التخفيف لمدة 3 دقائق في 300 x ز. بعد الطرد المركزي، وpirate المابير، وإضافة 10٪ DMEM إلى كل أنبوب 15 مل وفقا للجدول 1،والقيم المنصوص عليها في الجدول هو ل 2 مل من كل صياغة. تحييد كمية الكولاجين مع 10 ميكرولتر / مل NaOH (1 M)، وإضافة الكولاجين تحييد إلى تعليق الخلية، و 10٪ DMEM الحالي سوف تتحول الصفراء، مرة واحدة يتم خلط التعليق تماما عن طريق الأنابيب مع قطع تلميح أنها سوف تتحول وردي مشرق. إضافة الفيبرينوجين إلى تعليق خلية الكولاجين وفقا للجدول 1، وذلك باستخدام تلميح ماصة قطع، وخلط التعليق تماما. وأخيراً إضافة ثرومبين إلى الكولاجين-الفيبرينوجين تعليق الخلية, 0.1 ثرومبين KIU لكل 10 ملغ من الفيبرينوجين. إزالة إدراج المقلوب المغلفة مسبقا المعدة في القسم 2 من الحاضنة واستخدام قطع 200 ميكرولتر ماصة تلميح، ماص 200 μL من تعليق المعدة على إدراج المعينة. السماح للجل إلى crosslink لمدة 15 دقيقة داخل غطاء محرك التدفق laminar. بعد 15 دقيقة، ضع الجزء السفلي من اللوحة فوق المواد الهلامية ونقلها إلى الحاضنة للسماح للجلات بوصلة 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. مرة واحدة قد الهلام crosslinked، عكس إدراج مرة أخرى وإضافة 2 مل من 10٪ DMEM إلى كل من الآبار السفلية من لوحة. 4. بذر الخلايا البطانية سخني 25 مل هانكس متوازن محلول الملح (HBSS)، 10 مل التربسين، 10 مل مثبطات التربسين و 50 مل البطانية متوسطة النمو، إلى 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في حمام مائي. تحضير تعليق الخلية البطانية (HUVEC). غسل خلايا HUVEC في T175 قارورة الثقافة مرتين مع HBSS مل 10 مل. الخلايا التربسينيزي مع 6 مل التربسين لمدة 4 دقائق في 37 درجة مئوية. تعطيل التربسين مع مثبطات التربسين 6 مل. جمع تعليق الخلية في 15 مل من أنبوب والطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 200 × ز. بعد الطرد المركزي التعرق السوبر وتعليق الخلايا في 5 مل البطانية متوسطة النمو. عد الخلايا كما سبق وصفها في 3.4.6 باستخدام عداد خلية تلقائي. باستخدام عدد الخلايا من عداد الخلية، وإعداد كثافة البذر من 1.0 × 104 الخلايا / مل في وسط النمو البطانية. بذور 500 ميكرولتر من تعليق خلية HUVEC في كل بئر من الجزء العلوي من إدراج أن يكون حجم النهائي من 5.0 × 103 الخلايا لكل إدراج. 5. الصيانة استبدال متوسطة النمو كل يوم الثاني، الطامح قضى متوسط النمو من كل من البئر وإدراج. إضافة 2 مل 10٪ DMEM إلى الآبار التي تحتوي على هلام و 0.5 مل البطانية متوسطة النمو إلى إدراج التي تحتوي على خلايا HUVEC. الحفاظ على النموذج لمدة 21 يوما قبل التجريب. 6. علم الريولوجيا قياس معامل التخزين من تركيبات هلام للإشارة إلى قيم صلابة باستخدام rheometer، عن طريق تنفيذ التردد الاكتساحات من 0.1-20 هرتز في 0.267٪ و 37 درجة مئوية، مع قوة محورية ثابتة من 0.1N باستخدام 8 مم هندسة الفولاذ المقاوم للصدأ لوحة متوازية القطر. 7- القدرة على البقاء والاستجابة للمخدرات تحديد استجابة الدواء وقابليتها للبقاء في الثقافات المشتركة 2D ونموذج 3D. بذور HepG2 (5.0 × 103 خلايا / مل) و LX2 (5.0 × 103 خلايا / مل) في نسبة 1:1 لثقافة 2D المشتركة في قيعان سوداء واضحة 96-جيدا لوحات في كثافة البذر من 1.0 × 104 خلايا / مل. السماح للخلايا بالتعلق بين عشية وضحاها. إعداد النموذج ثلاثي الأبعاد ليتوافق مع بيئة cirrhotic بقيمة صلابة 6 كيلو باسكال. الحفاظ على النموذج لمدة 21 يوما قبل العلاج دوكسوروبيسين. ساعتين قبل العلاج دوكسوروبيسين, التعرق المتوسطة الثقافة من كل من نموذج 2D و 3D. غسل كلا النموذجين مرتين مع برنامج تلفزيوني. إضافة المتوسطة المجاعة (DMEM تستكمل مع 1٪ v / v محلول مضاد للمضادات الحيوية المضادة للغمية) إلى 2D المشتركة في الثقافة (200 ميكرولتر في البئر) وإلى نموذج 3D (2 مل إلى الآبار التي تحتوي على هيدروجيل و 500 ميكرولتر إلى إدراج). إدارة دوكسوروبيسين إلى كل من 2D ونموذج 3D. جرعات هي على النحو التالي: 0.5, 1 و 1.5 mM المقابلة لIC25, 50 و 75 القيم, على التوالي. علاج كلا النموذجين ل 72 ساعة.ملاحظة: دوكسوروبايسين، مثبط topoisomerase II، هو واحد من الأدوية العلاج الكيميائي الأولى المستخدمة لHCC وهو أيضا واحد من أكثر العوامل العلاجية الكيميائية النشطة في علاج HCC33،34. بعد 72 ساعة، يستنشق ثقافة المتوسطة من كل من نموذج 2D و 3D. تأكد من إزالة أي ثقافة متوسطة متبقية عن طريق غسل كلا النموذجين مرتين باستخدام PBS. إعداد AlamarBlue وفقا لتوصيات الشركة المصنعة وإضافة إلى آبار النموذج 2D و 3D. أضف 150 ميكرولتر في البئر لثقافة 2D و2 مل لكل بئر و500 ميكرولتر لكل إدراج لثقافة 3D. محتضنة بين عشية وضحاها في 37°C. بعد الحضانة نقل 150 ميكرولتر من AlamarBlue من كل بئر من الإعداد 3D في لوحة سوداء واضحة 96-well. يمكن قراءة AlamarBlue مباشرة من لوحة للنموذج 2D. قراءة الفلوريسنس مع قارئ microplate في الطول الموجي الإثارة والطول الموجي للانبعاثات من 485 و 550 نانومتر، على التوالي. حساب نسبة الخلية صلاحية في كلا النموذجين باستخدام الصيغة التالية:

Representative Results

نطاقات التركيز وحجم البذربروتوكول الأمثل للحصول على بروتوكول التشغيل النهائي وقعت وفقا للرسم التخطيطي المقدمة في الشكل 3. تم تحديد اثنين من الهيدروجيل ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية، نوع الكولاجين الأول وفيبرينوجين، عن طريق البحث الأدب35،36. بدءا من ذيل الفئران نوع الكولاجين الأول، مجموعة من التركيزات (4، 3، 2 و 1 ملغ / مل) تم بذر على إدراج مقلوب لتحديد قدرتها على التمسك بنجاح إدراج مرة واحدة مقلوب مرة أخرى. وكانت جميع التركيزات داخل هذا النطاق قادرة على تشكيل المواد الهلامية، ولكن الكولاجين المواد الهلامية يبدو بالارض وكان مختلف فقاعات الهواء المحاصرين داخلها بسبب المناولة و pipetting، انظر الشكل 4 والشكل 5. لتحديد حجم البذر الأمثل لتحسين نوعية هلام الكولاجين، مجموعة من وحدات التخزين البذر (100، 150 و 200 ميكرولتر)، تم بذرها على إدراج مقلوب، انظر الشكل 5. لم يكن لحجم البذر أي تأثير على مظهر الجل أو وجود فقاعات داخل الجل. وبناء على ذلك، تقرر أن 200 ميكرولتر هو حجم البذر الأمثل لإنتاج الهلام الكامل. كما تم تقييم الفيبرينوجين لقدرته على إنتاج هلام يمكن أن يلتزم بإدراج لفترة زمنية طويلة. تم إعداد نطاق تركيز (70، 50، 40، 30، 20، 10، 5، 1 ملغ/مل) وبذر في حجم 200 ميكرولتر على غطاء لوحة 12-well، انظر الشكل 6. في غضون 20 دقيقة بعد البذر جميع التركيزات كانت قادرة على تشكيل هلام بنجاح. ومع ذلك، تم استبعاد التركيزات 5 و 1 ملغ/مل كما كان الهلام شكلت السائل مثل الاتساق وبدأت في الانفصال عن الغطاء بعد أن أبقى بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. الشكل 3: مخطط تخطيطي لتحسين البروتوكول. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: المواد الهلامية الكولاجين 4 ملغ / مل تحتوي على 1.0 × 105 الخلايا / مل البذور على إدراج تظهر فقاعات موجودة في الجل. تم إزالة الغاز على اليسار على الجليد لمدة 15 دقيقة، في حين لم يتم إزالة الغاز على الإدراج على اليمين. لم يكن للانقاص أي تأثير على الفقاعات الموجودة في المواد الهلامية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 5: المواد الهلامية الكولاجين 4 ملغ/ مل تحتوي على 1.0 × 105 الخلايا / مل البذور على إدراج في أحجام مختلفة. (A) إدراج على اليسار 100 ميكرولتر، الأوسط 150 ميكرولتر والحق 200 ميكرولتر، مباشرة بعد البذر. كانت الفقاعات في المواد الهلامية لا تزال موجودة. (B) إدراج على اليسار 200 ميكرولتر، الأوسط 150 ميكرولتر والحق 100 ميكرولتر، بعد 60 دقيقة crosslinking. جميع المواد الهلامية بغض النظر عن حجم لا تزال تظهر مسطحة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 6: الفيبرينوجين (200 ميكرولتر) في نطاق تركيز يتراوح من 70 إلى 1 ملغ/مل مُصنف على غطاء صفيحة 12 بئراً. (A) المواد الهلامية مباشرة بعد البذر. (B) المواد الهلامية 20 دقيقة بعد البذر. (C) المواد الهلامية أبقى بين عشية وضحاها. جميع المواد الهلامية تبدو مقربة جيدا، واستبعد 5 ملغ/مل و 1 ملغم/ مل المواد الهلامية كما يبدو أن لديها اتساق أكثر السوائل 20 دقيقة بعد البذر وبدأت في الانفصال عن الغطاء بعد أن أبقى بين عشية وضحاها. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. مزيج الكولاجين والفيبرينوجيناستنادا إلى نتائج من الكولاجين و fibrinogen يتراوح تركيز تأثير الجمع بين الكولاجين والفيبرينوجين تم تقييمها. وكانت ثلاثة إدراج الإعداد مع ما يلي, 4 ملغ / مل الكولاجين, 20 ملغ / مل الفيبرينوجين و 1:1 حصة من الكولاجين (4 ملغ / مل) والفيبرينوجين (20 ملغ / مل), انظر الشكل 7. مباشرة بعد البذر الهيدروجيلس، لاحظنا أن إدراج مع الكولاجين وحده لا يزال مظهر مسطح جنبا إلى جنب مع حدوث فقاعات داخل الجل. أنتجت إدراج مع الفيبرينوجين هلام كامل ومستدير، لذلك لم إدراج مع مزيج من الكولاجين والفيبرينوجين. بعد ربط عبر في 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة، وقد تعلق جميع المواد الهلامية إلى إدراج وظلت تعلق بعد الحضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. الشكل 7: تأثير مزيج من الكولاجين والفيبرينوجين. (أ)الكولاجين 4 ملغ / مل بذر على إدراج على اليسار, الفيبرينوجين 20 ملغ / مل بذر على إدراج في الوسط والكولاجين 4 ملغ / مل, الفيبرينوجين 20 ملغ /مل (1:1 ration) بذر على إدراج على اليمين. جميع المواد الهلامية المبذرة في حجم 200 ميكرولتر تحتوي على 1.0 × 105 خلايا / مل، تم ربط جميع المواد الهلامية لمدة 60 دقيقة في 37 درجة مئوية (B) الكولاجين 4 ملغم / مل 60 دقيقة بعد crosslinking، وبدا هلام مسطحة وكان فقاعات. (C) إدراج على الفيبرينوجين الأيسر 20 ملغ / مل، هلام تظهر مدورة، لا فقاعات الحالية، تضاف على الكولاجين الحق 4 ملغ / مل، الفيبرينوجين 20 ملغ / مل هلام، يتم تقريب هلام جيدا مع عدم وجود فقاعات. (D) الكولاجين 4 ملغ / مل هلام بعد أن أبقى بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، هلام لا تزال تحتوي على كمية كبيرة من الفقاعات، وقد حدث بعض تورم من هلام. (E ) Fibrinogen 20 ملغ / مل أبقى بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية (F) الكولاجين 4 ملغ / مل, الفيبرينوجين 20 ملغ / مل هلام أبقى بين عشية وضحاها في 37 °C. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. تحديد كثافة بذر الخلايااستنادا إلى الخبرة السابقة للعمل مع الهيدروجيلس كانت تجربة إعداد لتحديد كثافة البذر الخلية الأمثل (البيانات غير مبينة)37. تم دمج الخلايا في مزيج من الكولاجين والفيبرينوجين في نطاق التركيز التالي (7.5 × 105، 8.5 × 105، 9.5 × 105، 1.0 x 106، 1.5 × 106 و 2.0 × 106 خلايا / مل) ، 2.0 × 106 خلايا / مل تم العثور على كثافة البذر الأمثل. علم أمراض الريتم تقييم عشر تركيبات من الفبرينوجين والكولاجين هيدروجيل عن طريق الريولوجيا، انظر الجدول 2. وكان الهدف هو تحديد أي من هذه التركيبات يمكن أن تحاكي تصلب الكبد الذي شوهد أثناء تطور HCC. قدمت الأدب قيم تصلب الكبد المعروفة للفئران والفئران والبشر أثناء التليف وتليف الكبد وHCC وكان الهدف هو الاقتراب قدر الإمكان من هذه القيم28,29,30,31,32. وقد تم إعداد التركيبات العشر كما هو مبين في الجدول 2 في ثلاث 333 وجرى تحديد معامل التخزين لكل منها باستخدام مقياس للريمتر، والنتائج المبينة في الشكل 8. صياغه الفيبرينوجين (ملغ / مل) الكولاجين (ملغ / مل) 1 60 2 2 50 2 3 40 2 4 30 2 5 20 2 6 10 2 7 20 5 8 20 4 9 20 3 10 20 1 الجدول 2: تركيبات الكولاجين والفيبرينوجين في مختلف التركيزات التي تم تقييمها مع الريولوجيا لتحديد قيم صلابة الشكل 8: قيم تصلب هيدروجيل لتركيبات الكولاجين والفيبرينوجين في مختلف التركيزات التي تم تقييمها مع الريولوجيا. تم تحديد معامل التخزين ومعامل الخسارة عند 37 درجة مئوية و1 هرتز بواسطة مقياس الRr-2 الهجين Discovery (n = 3، أشرطة الخطأ = SD). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. من هذه الصيغ العشر تم اختيار ثلاثة للمضي قدما. وشملت هذه 2 ملغ / مل نوع الكولاجين الأول و 10 ملغ / مل الفيبرينوجين المقابلة لقيم تصلب الكبد في بداية التليف، 2 ملغ / مل نوع الكولاجين الأول و 30 ملغ / مل الفايبرينوجين المقابلة لتليف الكبد و 2 ملغم / مل نوع الكولاجين الأول و 40 ملغ / مل فيبرينوجين المقابلة لHCC، انظر الشكل 9. الشكل 9: قيم صلابة هيدروجيل لمختلف تركيبات الفيبرينوجين/الكولاجين هيدروجيل التي تم اختيارها للاستمرار. تم تحديد معامل التخزين ومعامل الفقدان عند 37 درجة مئوية و1 هرتز (n = 3، أشرطة الخطأ = SD). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. القدرة على البقاء والاستجابة للمخدرات وإمكانية الانبثاثوأظهرت النتائج من فحص AlamarBlue إجمالي انخفاض صلاحية الخلية داخل الثقافة المشتركة 2D، أقل من المتوقع استناداً إلى المعروف IC 25، 50 و 75 القيم، بالمقارنة مع السيطرة غير المعالجة، انظر الشكل 10. قد يعزى ذلك إلى خلايا LX2 في ثقافتنا المشتركة التي هي أكثر حساسية لعلاج دوكسوروبيسين. ومع ذلك، في نموذجنا 3D لاحظنا وزيادة في مقاومة دوكسوروبيسين، مما يؤكد انخفاض في إمكانات العلاج الكيميائي غالبا ما ينظر في أنظمة نموذج 3D. تم تقييم الأهمية الإحصائية مقارنة بالضوابط باستخدام اختبار الطالب T (ذيلان) ، مع اعتبار P<0.05 مهمًا. الشكل 10: النسبة المئوية لصلاحية الخلية لنموذج الثقافة المشتركة 2D مقارنة مع نموذج 3D بعد العلاج مع دوكسوروبيسين بتركيزات مختلفة لفترة 72h. تم تطبيع النتائج بالنسبة إلى عنصر التحكم غير المعالج (n= 3، أشرطة الخطأ = SD) (* = p<0.0001). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. تم فحص ثوابت الجل بصريًا يوميًا باستخدام مجهر خفيف لمتابعة نمو الخلايا داخل تركيزات مختلفة من الهيدروجيل. ملأت الخلايا حتى الهيدروجيل بطريقة متجانسة ومدمجة، من اليوم 7 بدأت spheroids لتجميع داخل المصفوفة.

Discussion

يصف هذا البروتوكول تطوير طريقة لإنشاء نموذج حيوي لـ HCC. وقد تم تحديد سير عمل واضح وتحديد الخطوات الحاسمة التي تنطوي عليها. وتشمل هذه الخطوات الحاسمة, إعداد محلول الأسهم الفيبرينوجين, طلاء إدراج مع الكولاجين وبذر الخلايا imbedded في هيدروجيل. أثناء إعداد محلول الأسهم الفيبرينوجين من المهم إضافة الفيبرينوجين بزيادات أصغر بتركيزات أعلى. وهذا لن يقلل فقط من الوقت الذي يستغرقه الفيبرينوجين في حل ولكن أيضا منع الفيبرينوجين من الغيلينج غير متناسقة وسابق لأوانه كما رأينا في الشكل 11. إعداد هلام الفيبرينوجين يأخذ قدرا كبيرا من الوقت وهذا قد يؤثر على النجاح التجريبي العام. تشير النتائج إلى أنه بمجرد أن يبدأ هلام الفيبرينوجين في الهلام بشكل غير متسق فمن الأفضل التخلص منه. يجب أن تكون مغلفة إدراج مع الكولاجين، وغسلها مع برنامج تلفزيوني ومجففة داخل غطاء محرك التدفق الفاتن قبل بذر الخلايا جزءا لا يتجزأ من الهيدروجيل. الفشل في ضمان أن إدراج جافة سيؤدي إلى hydrogels سكب على حواف إدراج، مما أدى إلى هلام متفاوتة. التفاوت في الجل سيؤثر في نهاية المطاف على النتائج حيث الانتشار هو عامل.

الشكل 11: إعداد هلام الفيبرينوجين لتركيبات الفيبرينوجين/الكولاجين هيدروجيل. (A) محلول جل الفيبرينوجين الذي شكل كتل وبدأ في هلام قبل الأوان مع الفيبرينوجين غيرسولة التمسك الأنبوب. (B) محلول جل الفيبرينوجين الذي حل تماما، والحل واضح وأكثر قليلا لزجة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فمن المستحسن أن تعمل في أسرع وقت ممكن في حين بذر تعليق الخلية هيدروجيل على إدراج، كما سوف يبدأ المكون الفيبرينوجين إلى crosslink مع إضافة ثرومبين. إعداد أحجام العمل أصغر في وقت عند العمل مع تعليق هلام في تركيزات أعلى لمنع الجل من الربط المتبادل أثناء البذر. وسيكون لهذا الأخير تأثير على التوزيع وكمية من هلام بذر على كل بئر. ترتيب إضافة مكونات أمر بالغ الأهمية، في هذا البروتوكول قدمنا سير عمل مبسطة لمنع المواد الهلامية من الربط بين قبل الأوان. نظرا لللزوجة من تعليق هلام هيدروجيل العمل مع تلميح ماصة قطع ينصح أثناء خلط وقياس. عند خلط تعليق ضمان أن يتم ذلك بسرعة وبشكل متكافئ لخلق تعليق متجانسة. سوف يؤدي خلط متفاوتة في هلام غير متجانسة والتي سوف تؤثر سلبا على النتائج، انظر الشكل 12.

الشكل 12: الكولاجين / الفيبرينوجين المواد الهلامية بذر على 12 لوحات جيدا. جميع المواد الهلامية بذر في حجم 200 μL تحتوي على 2mg/مل الكولاجين و 20 ملغ / مل فيبرينوجين مع 2.0 × 10⁶الخلايا / مل. (أ)هلام هيدروجيل مع الاتساق غير متجانسة، وتوزيع غير متساو مرئية من الهيدروجيل. (ب) هيدروجيلس مختلطة بشكل متجانس. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بعد تحسين البروتوكول، تم تقييم النموذج لتحديد الخصائص الحيوية الفيزيائية للنماذج. وأظهرت بيانات الريولوجيا أن نموذجنا، الذي يتألف من مكونات مصفوفة خارج الخلية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية وهي نوع الكولاجين الأول والفيبرينوجين، كان قادرا على تقليد الخصائص الحيوية الفيزيائية للكبد الليفي، cirrhotic وHCC²⁸^،²⁹^،³⁰^،³¹^،³². تلخيص تصلب الكبد في النماذج 3D لHCC هو من أهمية كبيرة وغالبا ما يتم تجاهلها أثناء تطوير النموذج. ويرتبط زيادة تصلب الكبد لمقاومة العلاج الكيميائي, انتشار, الهجرة, وال السكون داخل في HCC³⁸. في حين يرتبط تنشيط الخلايا النجمية الكبدية في HCC بزيادة صلابة المصفوفة خارج الخلية ، مع العديد من مسارات الإشارة المرتبطة بهذه الخلايا النجمية الكبدية التي تظهر الحساسية^{الميكانيكية 39}.

أصبح إدراج الخلايا المرتبطة ب stroma مثل الخلايا النجمية الكبدية والخلية البطانية في تطوير نماذج ثلاثية الأبعاد لـ HCC وثيق الصلة بشكل متزايد. وتظهر الدراسات أن اللولبيات متعددة الخلايا تتألف من خلايا ممتاز الكبد وHCC أدى إلى زيادة المقاومة العلاجية الكيميائية والهجرة الغازية، في حين تحاكي ظهور ورم HCC في الجسم الحي، بالمقارنة مع نموذج الفئران PXT وعينات الأنسجة HCC الإنسان¹⁷. وجدت دراسة مماثلة أجراها Jung et al.، 2017 أن الخلايا متعددة الخلايا التي تتكون من سرطان الكبد (Huh-7) والخلايا البطانية (HUVEC) عززت الأوعية الدموية والعدوانية²². وأظهرت هذه spheroids قابلية البقاء في تركيزات أعلى بكثير من الدوكسيوروبينيسين وsorafenib بالمقارنة مع هوه -7 تربية أحادية الزفير²². تقييم جدوى نموذجنا والاستجابة لدوكسيوروبسين، مع قيم تصلب المقابلة لتلك التي من HCC وإدراج الخلايا المرتبطة الست stroma (LX2 وهوفيك)، وأظهرت انخفاضا مماثلا استجابة للعلاج الكيميائي بالمقارنة مع نموذج 2D المشتركة الثقافة. وهكذا، محاكاة فعالة مقاومة الأدوية ينظر عادة في المرضى ونماذج أخرى HCC 3D.

لأن هذا هو نظام وحدات يمكن تحصين النموذج بإضافة مكونات أخرى مصفوفة خارج الخلية وهي، اللامينين وحمض الهيالورونيك. بدلا من ذلك، يمكن استبدال الهيدروجيلات الحالية المستخدمة في هذا النموذج من قبل الهيدروجيل الاصطناعية مثل ألجينات الصوديوم أو الشيتوسان. ويمكن أن يكون المزيد من التعديلات على النموذج الحالي استبدال خطوط الخلية مع الثقافات الخلية الأولية لإنتاج نموذج أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية أو باستخدام مجموعات من الأورام الأخرى وخطوط الخلايا السترومال.

وهكذا قمنا بتطوير نموذج ثلاثي الأبعاد بنجاح مع خصائص حيوية فيزيائية قابلة للتواؤم لدراسة تفاعلات الورم القوي في HCC. لقد وجدنا نموذجنا ليكون أكثر تمثيلا للحالة في الجسم الحي بالمقارنة مع الثقافات التقليدية 2D ردا على دوكسوروبيسين. ومع ذلك ، لا يزال هناك الكثير الذي يتعين القيام به ، ونأمل أن تميز على نطاق واسع هذا النموذج واستكشاف النموذج باعتباره منصة النقيلي ممكن للإجابة على الأسئلة الأكثر تعقيدا وإلحاحا التي لا تزال قائمة في الدراسة HCC.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم تمويل هذا البحث من خلال المنح التي تم الحصول عليها من مؤسسة السرطان السويدية (Cancerfonden، CAN2017/518)، والجمعية السويدية للأبحاث الطبية (SSMF، S17-0092)، ومؤسسة O.E. أوتش إدلا يوهانسونس ومؤسسة أولغا جونسون. ولم تشارك مصادر التمويل هذه في تصميم الدراسة؛ جمع البيانات وتحليلها وتفسيرها؛ كتابة التقرير؛ وفي قرار تقديم المادة للنشر. تم إجراء الطباعة ثلاثية الأبعاد للفواصل المصممة خصيصًا المستخدمة في هذا البروتوكول في U-PRINT: مرفق الطباعة ثلاثية الأبعاد في جامعة أوبسالا في المجال التأديبي للطب والصيدلة ، U-PRINT@mcb.uu.se. ونود أن نشكر بول أوكالاهان على مساهمته القيمة في مشروعنا.

Materials

AlamarBlue (Resazurin sodium salt)	Sigma	211-500	Prepare according to manufacturesr recommendations
Antibiotic Antimycotic Solution (100×), Stabilized	Sigma	A5955-100ML
Aprotinin Protease Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	78432
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma	C1016-2.5KG	Anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0%
CO2 Incubator	Kebo Biomed Sweden
Corning Black, clear flat bottom 96-well plate	Sigma	CLS3904-100EA
Corning HTS Transwell-24 well permeable supports	Sigma	CLS3396-2EA	HTS Transwell-24 units w/ 0.4 μm pore polycarbonate membrane and 6.5 mm inserts, TC-treated, sterile, 2/cs
Discovery Hybrid Rheometer 2	TA instruments, Sollentuna, Sweden
DMEM, high glucose, GlutaMAX supplement (LX2 and HepG2 cells)	Thermo Fisher Scientific	61965059	Supplemented with 10% v/v FBS and 1% v/v antibiotic antimycotic solution
Endothelial Cell Growth Medium (500 ml) (HUVEC)	Cell Applications, Inc	211-500
Fetal Bovine Serum, qualified, One Shot format, New Zealand	Thermo Fisher Scientific	A3160902
Fibrinogen type I-S from bovine plasma	Sigma	F8630-10G
FLUOstar Omega plate reader	BMG Labtech
Hanks' balanced salt solution	Sigma	H9394-500ML	Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride and magnesium sulfate
Labogene scanspeed 416 centrifuge	Labogene, Sweden
Laminar flow hood	Kebo Biomed Sweden
Mettler Toledo AG245 Analytical Balance	Mettler Toledo
Nikon TMS Light microscope	Nikon, Japan
Phosphate buffered saline tablet	Sigma	P4417-100TAB	Prepare according to manufacturers recommendation
Rat tail Collagen Type I 5 mg/mL	Ibidi	50201
Sodium chloride (NaCl)	Sigma	S7653-1KG
Sodium Hydroxide (NaOH)	Merck	B619298
TC20 Automated cell counter	BioRad
TC20 cell counter counting slides	BioRad
Thrombin from bovine plasma	Sigma	T9549	Powder, suitable for cell culture, ≥1,500 NIH units/mg protein (E1%/280 = 19.5)
Trypsin (2.5%) 10x	Thermo Fisher Scientific		Dilute to 1x in PBS
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)	Sigma	T6414-100ML	Solution, sterile-filtered

References

Galle, P. R., et al. EASL Clinical practice guidelines: Management of hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 69, 182-236 (2018).
Marquardt, J. U., Andersen, J. B., Thorgeirsson, S. S. Functional and genetic deconstruction of the cellular origin in liver cancer. Nature Reviews Cancer. 15, 653-667 (2015).
Balogh, J., et al. Hepatocellular Carcinoma: A review. Journal of Hepatocellular Carcinoma. 3, 41-53 (2016).
Perumpail, R. B., Womg, R. J., Ahmed, A., Harrison, S. A. Hepatocellular carcinoma in the setting of non-cirrhotic non-alcoholic fatty liver disease and the metabolic syndrome: US experience. Digestive Diseases and Science. 60, 3142-3148 (2016).
Baglieri, J., Brenner, D. A., Kisseleva, T. The role of fibrosis and liver associated fibroblasts in the pathogenesis of hepatocellular carcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 20, 1723 (2019).
Arriazu, E., et al. Extracellular matrix and liver disease. Antioxidants & Redox Signaling. 21 (7), 1078-1097 (2014).
Malarkey, D. E., Johnson, K., Ryan, L., Boorman, G., Maronpot, R. R. New insight into functional aspects of liver morphology. Toxicologic Pathology. 33, 27-34 (2005).
Moreira, R. K. Hepatic stellate cells and liver fibrosis. Archive of Pathology and Lab Medicine. 131, 1728-1734 (2007).
Hernandez-Gea, V., Toffanin, S., Friedman, S. L., Llovet, J. M. Role of the microenvironment in the pathogenesis and treatment of hepatocellular carcinoma. Gastroenteroloy. 144, 512-527 (2013).
Amicone, L., Marchetti, A. Microenvironment and tumor cells: two targets for new molecular therapies of hepatocellular carcinoma. Translational Gastroenterology and Hepatology. 3, 24 (2018).
Rawal, P., et al. Endothelial cell-derived TGF-B promotes epithelial-mesenchymal transition via CD133 in Hbx-Infected Hepatoma cells. Frontiers in Oncology. 9 (308), 1-9 (2019).
Yoo, J. E., et al. Progressive enrichment of stemness features and tumour stromal alterations in multistep hepatocarcinogenesis. PLoS One. 12 (3), 0170465 (2017).
Landry, B. D., et al. Tumor-stroma interactions differentially alter drug sensitivity based on the origin of stromal cells. Molecular Systems Biology. 14, 8332 (2018).
Le, B. D., et al. Three-dimensional hepatocellular carcinoma/fibroblast model on a nanofibrous membrane mimics tumor cell phenotypic changes and anticancer drug resistance. Nanomaterials. 8 (64), 1-11 (2018).
Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery (Review). Oncology Letters. 14, 6999-7010 (2017).
Hoarau-Véchot, J., Rafii, A., Touboul, C., Pasquier, J. Halfway between 2D and animal models: Are 3D cultures the ideal tool to study cancer-microenvironment interactions. International Journal of Molecular Sciences. 19 (181), 1-24 (2018).
Khawar, I. A., et al. Three Dimensional Mixed-Cell Spheroids Mimic Stroma-Mediated Chemoresistance and Invasive Migration in hepatocellular carcinoma. Neoplasia. 20, 800-812 (2018).
Elliott, N. T., Yuan, F. A review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2010).
Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: focus on tumor spheroid model. Pharmacology Therapy. 163, 94-108 (2016).
Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
Jung, H. R., et al. Cell spheroids with enhanced aggressiveness to mimic human liver cancer in vitro and in vivo. Scientific Reports. 7, 10499 (2017).
Eilenberger, C., Rothbauer, M., Ehmoser, E. -. K., Ertl, P., Küpcü, S. Effect of spheroidal age on sorafenib diffusivity and toxicity in a 3D hepg2 spheroid model. Scientific Reports. 9, 4863 (2019).
Wrzesinski, K., Fey, S. J. After trypsinisation, 3D spheroids of C3A hepatocytes need 18 days to re-establish similar levels of key physiological functions to those seen in the liver. Toxicology Research. 2 (2), 123-135 (2013).
Wrzesinski, K., et al. Human liver spheroids exhibit stable physiological functionality for at least 24 days after recovering from trypsinisation. Toxicology Research. 2 (3), 163-172 (2013).
Mazza, G., et al. Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold of liver bioengineering and transplantation. Scientific Reports. 5, 13079 (2015).
Ma, X., et al. Rapid 3D bioprinting of decellularized extracellular matrix with regionally varied mechanical properties and biomimetic microarchitecture. Biomaterials. 185, 310-321 (2018).
Mueller, S., Sandrin, L. Liver stiffness: a novel parameter for the diagnosis of liver disease. Hepatic Medicine: Evidence and Research. 2, 49-67 (2010).
Wang, M. H., et al. In vivo quantification of liver stiffness in a rat model of hepatic fibrosis with acoustic radiation force. Ultrasound in Medicine & Biology. 35 (10), 1709-1721 (2009).
Georges, P. C., et al. Increased liver stiffness of the rat liver precedes matrix deposition: implications for fibrosis. American Journal of Physiology – Gastrointestinal and Liver Physiology. 293, 1147-1154 (2007).
Massironi, S., et al. et al. Liver stiffness and hepatocellular carcinoma: is it really useful. Journal of Hepatology. 58, 293 (2013).
Singh, S., et al. Liver stiffness is associated with risk of decompensation, liver cancer, and death in patients with chronic liver diseases: A systematic review. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 11, 1573-1584 (2013).
Yang, T. S., Wang, C. H., Hsieh, R. K., Chen, J. S., Fung, M. C. Gemcitabine and doxorubicin for the treatment of patients with advanced hepatocellular carcinoma: a phase I-II trail. Annals of Oncology. 13, 1771-1778 (2002).
Le Grazie, M., Biagini, M. R., Tarocchi, M., Polvani, S., Galli, A. Chemotherapy for hepatocellular carcinoma: the present and the future. World Journal of Hepatology. 9 (21), 907-920 (2017).
Saneyasu, T., Akhtar, R., Sakai, T. Molecular cues guiding matrix stiffness in liver fibrosis. BioMed Research International. 2016, 1-11 (2016).
Zuliani-Alvarez, L., Midwood, K. S. Fibrinogen-related proteins in tissue repair: how a unique domain with common structure controls diverse aspects of wound healing. Advances in Wound Care. 4 (5), 273-285 (2015).
Smit, T., et al. Characterization of an alginated encapsulated LS180 spheroid model for anti-colorectal cancer compound screening. ACS Medicinal Chemistry Letters. 11 (5), 1014-1021 (2020).
Schrader, J., et al. Matrix stiffness modulates proliferation, chemotherapeutic response, and dormancy in hepatocellular carcinoma cells. Hepatology. 53 (4), 1192-1205 (2011).
Lachowski, D., et al. Matrix stiffness modulates the activity of MMP-9 and TIMP-1 in hepatic stellate cells to perpetuate fibrosis. Scientific Reports. 9, 7299 (2018).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Calitz, C., Pavlović, N., Rosenquist, J., Zagami, C., Samanta, A., Heindryckx, F. A Biomimetic Model for Liver Cancer to Study Tumor-Stroma Interactions in a 3D Environment with Tunable Bio-Physical Properties. J. Vis. Exp. (162), e61606, doi:10.3791/61606 (2020).

Automatically Generated