神経癌の生物模倣モデルが、調整可能な生体特性を有する3D環境における腫瘍-ストロマ相互作用を研究する

図1:3DバイオミメティックHCCモデルの作成のグラフィカルな描写は、この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 注 : このプロトコルの全体的なワークフローは、図 1の図に示されています 1. フィブリノーゲンストック溶液の調製 1 M塩化カルシウム(CaCl2)ストック溶液を2.21 gのCaCl2の重量を量り、20 mL蒸留水(dH2O)に加えて調製します。ストック溶液は室温(RT)で保存することができます。 20 mL アプロチニンストック溶液(1218.75 KIU/mL)を調製し、5 mgのアプロチニンを計量し、20 mL dH2O. アリコのストック液を 1 mL アリコートに加え、-20 °Cで保管します。 80 mg/mL フィブリノーゲンのストック液を 10 mL 準備します。 50 mLチューブには、7.849 mLリン酸緩衝生理食塩液(PBS)、2.051 mLアプロチニンストック(1218.75 KIU/mL)を加え、最終的なアプロチニン濃度は250 KIU/mL、100 μL CaCl 2(1M)の最終CaCl2濃度は10mmです。 フィブリノーゲンの800mgの重量を量る。 ストック溶液に2%w/v NaClを含む200mgの塩化ナトリウム(NaCl)を秤量する。 PBS、アプロチニンおよびCaCl2を含む50 mLチューブに、フィブリノーゲンおよびNaClを増分で加える。これはフィブリノーゲンゲル化と溶液中の塊が形成するので、激しくかき混ぜたり振ったりしないでください。 フィブリノーゲンストック溶液の50 mLチューブをシェーカーの上に水平に置き、300rpmの低い設定で振ります。 溶液が溶解したら、0.22 μmのシリンジフィルターまたはボトルトップフィルターを使用して、ボリュームに応じてフィルターします。重要なことに、フィブリノーゲン溶液はフィブリノーゲンを破壊するので、オートクレーブしないでください。注:プロトコルのこの部分は、ストックソリューションの量に応じて2〜5時間かかる場合があり、この時間は実験的なセットアップ中に考慮する必要があります。 2. インサートにヒドロゲルを播種する前にコラーゲンを入れ物にコーティングする 薄層流れフードまたは組織培養フードでは、殺菌されたピンセットを使用して、プレートからインサートを取り除き、プレートの蓋に反転させます。 25 mLの氷酢酸を25 mLのdH2Oに加え、0.22 μmのシリンジフィルターを使用して溶液をフィルター処理して、100 mLの最終体積に調整して、20 mMの氷酢酸ストック液を100 mL調製します。ストックソリューションはRTに保存できます。 5 mg/mLコラーゲン溶液から2mLの100 μg/mLコラーゲン溶液を、2.2で調製した20mMの氷酢酸ストック溶液の1.960 mLに40 μL添加して調製します。 100 μL の溶液を各インサートにピペット処理して、2.3 で調製した 100 μg/mL コラーゲン溶液でインサートをコーティングします。ラミナーフローフードまたは組織培養フード内で空気を 2~3時間乾燥させます。 一度挿入物は、PBSで3倍の各インサートを乾燥洗浄した。12ウェルプレートの各ウェルにPBSの1mLを追加し、ウェルに下向きのコラーゲンコーティングでインサートを置き、井戸からPBSを取り除き、手順を繰り返します。層流フード1〜2時間内に空気を乾燥させておきます。注意:酢酸は細胞に有毒であり、挿入物はPBSで十分に洗浄する必要があります。 挿入物の上にカスタム3Dプリントスペーサーを追加し、これはゲルがプレートの底部ウェルに触れないように挿入物からぶら下がったら必要になります(図2)。 図2:カスタム3Dプリントスペーサこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 逆のインサートをプレートの下部で覆い、細胞がヒドロゲルに埋め込まれ、シードの準備ができるまでインキュベーターに入れられます。 3. インサートにヒドロゲルに埋め込まれた細胞を播種する 注: 表1 は、調製されるフィブリノーゲンの様々な濃度を有する3つの製剤の説明を提供する。製剤1は、線維症の発症時に肝臓に対応し、2つの肝硬変および3つのHCC、これらの製剤の各々に対する剛性値をプロトコル最適化中にレージロジーで決定した。 定式 化 最終フィブリノーゲン濃度(mg/mL) 最終コラーゲン濃度(mg/mL) 細胞(LX2+ヘプG2共培養1:1) 肝臓のステージ 文献肝臓剛性値 (kPa) モデルの剛性値(kPa) 定式 化 追加するフィブリノゲン (mL) 追加するコラーゲン (mL) 10% DMEM (mL) トロンビン (μL) 参照s 1 10 2 2 x 106 細胞/mL 線 維 症 ≥2 3 1 1 0.8 0.2 4 28;29;30 2 30 2 2 x 106 細胞/mL 肝硬変 6 2 0.75 0.8 0.45 3 3 40 2 2 x 106 細胞/mL Hcc ≥10 10 3 0.25 0.8 0.95 1 28;31;32 表1:インサートにヒドロゲルに埋め込まれた細胞を播種するための製剤の説明 1 M水酸化ナトリウムのストック液を、3.99 gの NaOH を 100 mL の dH2O に加えて調製します。 このソリューションは、0.22 μmのシリンジフィルターを使用してフィルタリングできます。RTにストックソリューションを保存します。 5 mg/mL コラーゲンと1M NaOHの10 mLを氷の上に置きます。 50 mL PBS、15 mL トリプシン、70 mL 10% DMEM、およびフィブリノーゲンストック溶液を、セクション1で調製し、水浴中で20分間37°Cに予熱します。 細胞懸濁液を準備します。 T175培養フラスコで肝細胞(LX2)および肝臓癌(HepG2)細胞を10mLのPBSで2回洗浄します。 トリプシンは、37°Cで4分間、6 mLトリプシンで細胞をトリプシン化する。 10%DMEMの6 mLでトリプシンを不活性化します。 300 x gで 3 分間、15 mL チューブと遠心分離機でセル懸濁液を回収します。 遠心分離後、上清を吸引し、各細胞株を10%DMEMの5mLで再懸濁する。 自動セルカウンターを使用してセルをカウントする:各セルサスペンションの10 μLを計数チャンバースライドに加え、スライドをセルカウンターに挿入します。セル数はセル/mLとして表示されます。 ステップ3.4.6の細胞数を使用して、各細胞株の細胞を1mLあたり1 x 106 細胞に希釈し、明らかにマークされた15 mLチューブにします。300xgで3分間の希釈を遠心分離 する。 遠心分離後、表1に従って上清を吸引し、各15mLチューブに10%DMEM を加え、表に記載された値は各製剤の2mLに対してである。 コラーゲンの量を10μL/mL NaOH(1M)で中和し、中和したコラーゲンを細胞懸濁液に加え、存在する10%DMEMが黄色に変わり、カットチップでピペット化して十分に混合すると明るいピンク色になります。 表1に記載のコラーゲン細胞懸濁液にフィブリノーゲンを加え、カットピペットチップを使用し、懸濁液を十分に混合する。 最後に、コラーゲン-フィブリノーゲン細胞懸濁液にトロンビンを加え、フィブリノーゲンの各10mgごとに0.1 KIUトロンビンを加える。 セクション2で準備した事前被覆インサーをインキュベーターから取り出し、カット200 μLピペットチップを使用して、準備された懸濁液のピペット200μLを指定されたインサートに取り出します。ラミナーフローフード内でゲルを15分間クロスリンクします。 15分後、プレートの底部をゲルの上にそっと置き、インキュベーターに移して、ゲルを37°Cで45分間クロスリンクさせます。 ゲルがクロスリンクされたら、挿入物を再び反転し、プレートの各底部ウェルに2 mLの10%DMEMを加えます。 4. 内皮細胞の播種 25 mLハンクバランス塩溶液(HBSS)、10 mLトリプシン、10 mLトリプシン阻害剤および50 mL内皮成長培地を、水浴中で20分間37°Cに予熱する。 内皮(HUVEC)細胞懸濁液を調製する。 10 mL HBSSで2回T175培養フラスコでHUVEC細胞を洗浄します。 トリプシンは、37°Cで4分間、6 mLトリプシンで細胞をトリプシン化する。 6 mL トリプシン阻害剤でトリプシンを不活性化します。200 x gで 3 分間チューブと遠心分離機の 15 mL でセル懸濁液を収集します。 遠心分離後、上清を吸引し、5mL内皮増殖培地で細胞を懸濁させた。 3.4.6 で説明したとおりに、セルの自動カウンタを使用してセルをカウントします。 細胞カウンターからの細胞数を使用して、内皮増殖培地で1.0 x 104 細胞/mLの播種密度を調製する。 HUVEC細胞懸濁液の種子500 μLは、挿入部の上部の各ウェルに入れ、挿入ごとに5.0 x 103 セルの最終容積を有します。 5. メンテナンス 2日ごとに成長培地を交換し、吸引はウェルとインサートの両方から成長培地を使用した。HUVEC細胞を含むインサートに、ゲルを含むウェルに2 mL 10%DMEMを加え、0.5 mL内皮増殖培地を添加します。 実験前の21日間、モデルを維持します。 6. レロジー ゲル製剤の貯蔵弾性率を測定して、リメーターを使用して剛性値を示し、0.267%および37°Cで0.1〜20 Hzの周波数スイープを行い、直径8mmの平行プレートステンレス鋼形状を使用して0.1Nの一定の軸力を有する。 7. 生存率と薬剤反応 2Dの共同培養および3Dモデルにおける薬剤の反応と生存率を決定する。 播種 HepG2 (5.0 x 103 細胞/mL) および LX2 (5.0 x 103 細胞/mL) 1:1 の比率で 2D 共培養 1:1 の比率で、1.0 x 104 細胞/mL の播種密度で黒い透明底 96 ウェルプレートにシードします。 セルを一晩で接続できるようにします。 剛性値が 6 kPa の肝硬変環境に対応するように 3D モデルを設定します。 ドキソルビシン処理前の21日間、モデルを維持します。 ドキソルビシン処理の2時間前に、培養培地を2Dおよび3Dモデルの両方から吸引する。両方のモデルをPBSで2回洗います。2D共培養液(ウェルあたり200μL)と3Dモデル(インサートにヒドロゲルを含むウェルに2 mL、インサートに500 μL)に飢餓培地(DMEMに1/v抗ミコティック抗生物質溶液を添加)を加えます。 ドキソルビシンを2Dと3Dモデルの両方に投与します。 投与量は以下の通り、IC25、50および75の値にそれぞれ対応する0.5、1および1.5mMである。 72時間の両方のモデルを扱います。注:トキソメラーゼII阻害剤であるドキソルビシンは、HCCに使用される最初の化学療法薬の1つであり、HCC 33,34の治療において最も活性な化学療法薬の1つでもあります。 72時間後、2Dおよび3Dモデルの両方から培養培地を吸引した。残りの培養培地は、両方のモデルをPBSで2回洗浄して除去するようにしてください。 メーカーの推奨事項に従ってAlamarBlueを準備し、2Dと3Dモデルの井戸に追加します。2D培養用のウェルあたり150μL、ウェルあたり2 mL、3D培養用インサートあたり500 μLを加えます。 37°Cで一晩インキュベート。 3Dセットアップの各ウェルからAlamarBlueの150 μLを黒いクリアボトム96ウェルプレートに移します。AlamarBlueは2Dモデルのプレートから直接読み取ることができます。 励起波長と発光波長485と550nmのマイクロプレートリーダーで蛍光を読み取ります。 次の式を使用して、両方のモデルでセルの生存率の割合を計算します。