تحليل ومواصفات توزيعات حجم حبيبات النشا
Summary
يُعرض هنا إجراء لتحديدات قابلة للاستنساخ وصحيحة إحصائياً لتوزيعات حجم حبيبات النشا، ولتحديد توزيعات حجم اللوغاريتم الحبيبي المحدد باستخدام نموذج مضاعف من معلمتين. وهو ينطبق على جميع تحاليل التحجيم الحبيبية لعينات النشا على نطاق الجرام لأبحاث علوم النبات والغذاء.
Abstract
تتكون النشا من جميع المصادر النباتية من حبيبات في مجموعة من الأحجام والأشكال التي لها ترددات مختلفة ، أي تعرض حجمًا وتوزيعًا علىالشكل. 12- وغالباً ما تكون بيانات حجم حبيبات النشا التي تحدد باستخدام عدة أنواع من تقنيات التحجيم الجسيمات إشكالية بسبب ضعف إمكانية التكاثر أو عدم وجود أهمية إحصائية ناتجة عن بعض الأخطاء المنهجية التي لا يمكن التغلب عليها، بما في ذلك الحساسية لأشكال الحبيبات وحدود أحجام العينات الحبيبية. وقد حددنا إجراءً لتحديدات قابلة للاستنساخ وصالحة إحصائياً لتوزيعات حجم حبيبات النشا باستخدام تقنية منطقة الاستشعار الكهربائي، ولتحديد توزيعات حجم اللوغاريتمي الحبيبي المحدد باستخدام نموذج مضاعف من معلمتين معتمدين مع دقة أفضل وقابلية للمقارنة. وهو ينطبق على جميع تحليلات التحجيم الحبيبية لعينات النشا على نطاق الجرام، وبالتالي، يمكن أن تسهل الدراسات حول كيفية تشكيل أحجام حبيبات النشا بواسطة جهاز وآليات التركيب الحيوي للنشا؛ وكيف تؤثر على خصائص ووظائف النشويات للاستخدامات الغذائية والصناعية. وتقدم النتائج التمثيلية من تحاليل تكرار توزيعات حجم الحبيبات لعينات النشا سويتبوتاتو باستخدام الإجراء المبين. ناقشنا كذلك العديد من الجوانب التقنية الرئيسية للإجراء ، وخاصة ، المواصفات المضاعفة لتوزيعات حجم اللوغاريتمي الحبيبية وبعض الوسائل التقنية للتغلب على انسداد الفتحة المتكررة بواسطة مجاميع الحبيبية.
Introduction
حبيبات النشا هي الهيكل المادي الذي اثنين من البوليمرات الاحتياطي الرئيسي homoglucan في التمثيل الضوئي النباتي والأنسجة التخزينية، والأميلوز الخطي أو المتفرعة بشكل ضئيل واميللوبيكتين متفرعة للغاية، هي معبأة بشكل منظم جنبا إلى جنب مع بعض المكونات الثانوية، بما في ذلك الدهون والبروتينات. حبيبات النشا من مختلف أنواع النباتات عرض العديد من الأشكال ثلاثية الأبعاد (3D) (استعرضت في المرجع1،2) ، بما في ذلك المجالات ، الإهليلجيات ، متعدد الوهيدونات ، الصفائح الدموية ، مكعبات ، التكعيب ، والبيبات غير النظامية. حتى تلك من الأنسجة نفسها أو أنسجة مختلفة من نفس الأنواع النباتية يمكن أن يكون لها مجموعة من الأشكال مع ترددات مختلفة الحدوث. وبعبارة أخرى، قد يكون حبيبات النشا من نوع نباتي توزيعاً إحصائياً مميزًا، بدلاً من شكل محدد. الأشكال غير الموحدة وغير الكروية حبيبات تجعل من الصعب قياس وتحديد أحجام حبيبات النشا بشكل صحيح. بالإضافة إلى ذلك، حبيبات النشا من نفس أنسجة الأنواع النباتية هي من مجموعة من الأحجام بنسب مختلفة، أي عرض توزيع حجم مميز. هذا التوزيع حجم يزيد من تعقيد تحليل ووصف أحجام حبيبات النشا.
وقد تم تحليل أحجام حبيبات النشا باستخدام عدة فئات من تقنيات تحجيم الجسيمات (استعرضت في المرجع3)،بما في ذلك المجهر، الترسب/ تجزئة تدفق الحقل (Sd/StFFF)، حيود الليزر ومنطقة الاستشعار الكهربائي (ESZ). ومع ذلك، هذه التقنيات ليست مناسبة على قدم المساواة لتحديد أحجام حبيبات النشا في وجود شكل حبيبة وتوزيع الحجم. المجهر، بما في ذلك المجهر الإلكتروني الخفيف والخلطي والمسح الضوئي، ممتاز لدراسات المورفولوجيا4،5،6،7،هيكل8،9 والتطوير10،11 من حبيبات النشا، ولكن لا يكاد يصلح لتحديد توزيعات حجمها بسبب بعض أوجه القصور الكامنة. القياسات المباشرة لصور الحبيبات المجهرية أو تحليل الصور بمساعدة البرامجية لبيانات المجهر البصرية (IAOM) ، والتي استخدمت لتحديد أحجام الحبيبات من النشويات من عدة أنواع ، بما في ذلك الذرة12، القمح13،14، البطاطا15 والشعير16، يمكن قياس فقط 1D (عادة أقصى طول) أو 2D (مساحة السطح) أحجام من أعداد محدودة جدا (عشرات إلى بضعة آلاف) من صور حبيبات النشا. نادراً ما تكون أحجام أخذ العينات الحبيبية الصغيرة المقيدة بطبيعتها بواسطة التقنيات تمثيلية إحصائياً، بالنظر إلى أعداد الحبيبات الهائلة لكل وحدة وزن من النشا (~ 120 × 106 لكل غرام، على افتراض أن جميع 10 ميكرومتر في كثافة 1.5 غرام/سم مكعب)، وبالتالي، يمكن أن تؤدي إلى سوء تكرار النتائج. قد يكون لتقنية SD/StFFF سرعة عالية ودقة عالية، وأحجام ضيقة من حبيبات النشا17، ولكن نادراً ما استخدمت بسبب أن دقتها قد تتأثر بشدة بالضرر والأشكال المختلفة وكثافة حبيبات النشا. تقنية الانعراج بالليزر هي الأكثر استخداماً، وقد تم تطبيقها على تحليلات حجم حبيبات النشا لجميع أنواع المحاصيل الرئيسية3،14،16. على الرغم من أن هذه التقنية لها العديد من المزايا، إلا أنها في الواقع غير مناسبة لتحديد أحجام حبيبات النشا في وجود توزيع شكل حبيبات. تعتمد معظم أدوات الانعراج بالليزر المتزامنة على نظرية Mie-scattering18 للجسيمات الكروية الموحدة ونظرية ميالمعدلة 18 لبعض الأشكال الأخرى من التوحيد. هذه التقنية هي ، بالتالي ، بطبيعتها حساسة جدا لأشكال الجسيمات ، وليس مناسبة تماما حتى بالنسبة لبعض الأشكال من التوحيد19، ناهيك عن حبيبات النشا وجود مجموعة من الأشكال ذات أبعاد متفاوتة. تقيس تقنية ESZ اضطراب الحقل الكهربائي بما يتناسب مع حجم الجسيمات التي تمر عبر فتحة. ويوفر حجم الحبيبات، فضلا عن عدد وحجم المعلومات التوزيع، وما إلى ذلك، في دقة عالية. وبما أن تقنية ESZ مستقلة عن أي خصائص بصرية للجسيمات بما في ذلك اللون أو الشكل أو التركيب أو مؤشر الانكسار ، والنتائج قابلة للاستنساخ للغاية ، فهي مناسبة بشكل خاص لتحديد توزيعات الحجم من حبيبات النشا التي لها مجموعة من الأشكال.
كما تم تحديد أحجام حبيبات النشا باستخدام العديد من المعلمات. وكثيرا ما وصفت مبسطة من قبل متوسط أقطار، والتي كانت في بعض الحالات وسيلة الحسابية لقياس مجهري أطوال القصوى من الصور 2D12،20، أو متوسطات من أقطار الكرة ما يعادل3. في حالات أخرى، تم تحديد توزيعات حجم الحبيبات باستخدام نطاقات الحجم21،22، متوسط حجم التوزيع أو متوسط القطر (مكافئ الكرة ، مرجحًا بالرقم أو الحجم أو المساحة السطحية) على افتراض التوزيع العادي14،23،24،25،26. هذه الأوصاف من أحجام حبيبات النشا من مختلف التحليلات هي ذات طبيعة مختلفة إلى حد كبير، وليس قابلة للمقارنة بدقة. قد يكون مضللا جدا إذا كانت هذه “الأحجام” من حبيبات النشا من أنواع مختلفة أو حتى نفس الأنسجة من نفس النوع مقارنة مباشرة. وعلاوة على ذلك، تم تجاهل معلمة انتشار (أو شكل) التوزيعات العادية المفترضة، أي الانحراف المعياري σ (أو الانحراف المعياري البياني σg)لقياس عرض التوزيع (أي انتشار الأحجام)، في معظم الدراسات.
لحل القضايا الحرجة المذكورة أعلاه التي تواجه تحليلات التحجيم حبيبات النشا، حددنا إجراء لتحديد قابلة للاستنساخ وصالحة إحصائيا من توزيعات حجم الحبيبات من عينات النشا باستخدام تقنية ESZ، وتحديد بشكل صحيح توزيعات حجم اللوغاريتم الحبيبي المحدد باستخدام نموذج مضاعف27 معلمة معتمدة مع تحسين الدقة وقابلية المقارنة. للتحقق من صحة وبيان، قمنا بإجراء تحليل تحجيم حبيبات تكرار عينات النشا sweetpotato باستخدام الإجراء، وحددت اللوغاريتمي التفاضلي حجم النسبة المئوية حجم ما يعادل المجال توزيعات قطر باستخدام وسائلها الهندسية الرسم 
والانحرافات المعيارية تضاعف s* في س/ (ضرب وتقسيم) s* النموذج.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد حل الإجراء المبين بعض القضايا الحرجة في العديد من الطرق القائمة لتحليل حجم حبيبات النشا، بما في ذلك غير ملائمة 1D أو 2D التحجيم حبيبات 3D، تشويه القياسات التحجيم بسبب الأشكال غير موحدة حبيبات، وسوء استنساخ وصحة إحصائية مشكوك فيها بسبب أحجام عينات الحبيبية محدودة، مواصفات غير دقيقة أو غي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل جزئياً مركز البحوث الزراعية التعاونية، ومركز أبحاث الأمن الغذائي المتكامل التابع لكلية الزراعة والعلوم الإنسانية، جامعة برايري فيو إيه أند إم. نشكر هوا تيان على دعمه الفني.
Materials
| Analytical beaker | Beckman Coulter Life Sciences | A35595 | Smart-Technology (ST) beaker |
| Aperture tube, 100 µm | Beckman Coulter Life Sciences | A36394 | For the MS4E, , 1000 µm |
| Disposable transfer pipettor, | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 13-711-9AM | Other disposable transfer pipettors with similar orifice can also be used. |
| Fisherbrand Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50 ml | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 05-539-13 | Any other similar types of tubes can be used. |
| Glass beakers, 150 to 250 ml | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 02-540K | These beakers are used to contain methanol for washing the aperture tube and stirer between runs. |
| LiCl | Fisher Chemical | L121-100 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A412-500 | Buy in bulk as the analysis uses a large quantity of methanol. |
| Mettler Toledo ML-T Precision Balances | Mettler Toledo | 30243412 | Any other precision balance with a readablity 0.01 g to 1 mg will work. |
| Multisizer 4e Coulter Counter | Beckman Coulter Life Sciences | B23005 | The old model, Multisizer 3 can also be used with slight adjustment of parameters. The 4e model comes with a 100 μm aperture tube. Other aperture tubes of different diameter can be purchased separately from the company. |
| Ultrasonic processor UP50H | Hielscher Ultrasound Technology | UP50H | Other laborator sonicator having a low-power (<50 Watt) output can be also used. Both MS1 and MS2 sonotrodes for the particular sonicator can be used to disperse starch granules in 5 ml methanol. Always use the lowest setting first, 20% amplitude and 0.1 or 0.2 cycle, and raise the setting if aggregates persist in suspension. |
References
- Shannon, J. C., Garwood, D. L., Boyer, C. D., BeMiller, J., Whistler, R. . Starch:Chemistry and Technology Food Science and Technology. , 23-82 (2009).
- Singh, N., Singh, J., Kaur, L., Singh Sodhi, N., Singh Gill, B. Morphological, thermal and rheological properties of starches from different botanical sources. Food Chemistry. 81 (2), 219-231 (2003).
- Lindeboom, N., Chang, P. R., Tyler, R. T. Analytical, biochemical and physicochemical aspects of starch granule size, with emphasis on small granule starches: a review. Starch – Stärke. 56 (34), 89-99 (2004).
- Baldwin, P. M., Davies, M. C., Melia, C. D. Starch granule surface imaging using low-voltage scanning electron microscopy and atomic force microscopy. International Journal of Biological Macromolecules. 21 (1-2), 103-107 (1997).
- Jane, J. L., Kasemsuwan, T., Leas, S., Zobel, H., Robyt, J. F. Anthology of starch granule morphology by scanning electron microscopy. Starch-Stärke. 46 (4), 121-129 (1994).
- Matsushima, R., Nakamura, Y. . Starch: Metabolism and Structure. , 425-441 (2015).
- Wang, S. -. q., Wanf, L. -. l., Fan, W. -. h., Cao, H., Cao, B. -. s. Morphological analysis of common edible starch granules by scanning electron microscopy. Food Science. 32 (15), 74-79 (2011).
- Baldwin, P. M., Adler, J., Davies, M. C., Melia, C. D. Holes in starch granules: confocal, SEM and light microscopy studies of starch granule structure. Starch-Stärke. 46 (9), 341-346 (1994).
- Chakraborty, I., Pallen, S., Shetty, Y., Roy, N., Mazumder, N. Advanced microscopy techniques for revealing molecular structure of starch granules. Biophysical Reviews. 12 (1), 105-122 (2020).
- Bechtel, D. B., Wilson, J. D. Amyloplast formation and starch granule development in hard red winter wheat. Cereal Chemistry. 80 (2), 175-183 (2003).
- Evers, A. Scanning electron microscopy of wheat starch. III. Granule development in the endosperm. Starch-Stärke. 23 (5), 157-162 (1971).
- Wang, Y. J., White, P., Pollak, L., Jane, J. L. Characterization of starch structures of 17 maize endosperm mutant genotypes with Oh43 inbred line background. Cereal Chemistry. 70, 171-179 (1993).
- Peng, M., Gao, M., Abdel-Aal, E. S. M., Hucl, P., Chibbar, R. N. Separation and characterization of A-and B-type starch granules in wheat endosperm. Cereal Chemistry. 76, 375-379 (1999).
- Wilson, J. D., Bechtel, D. B., Todd, T. C., Seib, P. A. Measurement of wheat starch granule size distribution using image analysis and laser diffraction technology. Cereal Chemistry. 83 (3), 259-268 (2006).
- Liu, Q., Weber, E., Currie, V., Yada, R. Physicochemical properties of starches during potato growth. Carbohydrate Polymers. 51 (2), 213-221 (2003).
- Chmelik, J., et al. Comparison of size characterization of barley starch granules determined by electron and optical microscopy, low angle laser light scattering and gravitational field-flow fractionation. Journal of the Institute of Brewing. 107 (1), 11-17 (2001).
- Moon, M. H., Giddings, J. C. Rapid separation and measurement of particle size distribution of starch granules by sedimentation/steric field-flow fractionation. Journal of Food Science. 58 (5), 1166-1171 (1993).
- Wriedt, T., Wolfram, H., Wriedt, T. . The Mie Theory: Basics and Applications. , 53-71 (2012).
- Schuerman, D. W., Wang, R. T., Gustafson, B. &. #. 1. 9. 7. ;. S., Schaefer, R. W. Systematic studies of light scattering. 1: Particle shape. Applied Optics. 20 (23), 4039-4050 (1981).
- Goering, K. J., Fritts, D. H., Eslick, R. F. A study of starch granule size and distribution in 29 barley varieties. Starch-Stärke. 25 (9), 297-302 (1973).
- Chen, Z., Schols, H. A., Voragen, A. G. J. Starch granule size strongly determines starch noodle processing and noodle quality. Journal of Food Sciences. 68 (5), 1584-1589 (2003).
- Dai, Z. M. Starch granule size distribution in grains at different positions on the spike of wheat (Triticum aestivum L.). Starch-Starke. 61 (10), 582-589 (2009).
- Edwards, M. A., Osborne, B. G., Henry, R. J. Effect of endosperm starch granule size distribution on milling yield in hard wheat. Journal of Cereal Science. 48 (1), 180-192 (2008).
- Karlsson, R., Olered, R., Eliasson, A. C. Changes in starch granule size distribution and starch gelatinization properties during development and maturation of wheat, barley and rye. Starch – Starke. 35 (10), 335-340 (1983).
- Li, W. -. Y., et al. Comparison of starch granule size distribution between hard and soft wheat cultivars in Eastern China. Agricultural Sciences China. 7 (8), 907-914 (2008).
- Park, S. H., Wilson, J. D., Seabourn, B. W. Starch granule size distribution of hard red winter and hard red spring wheat: Its effects on mixing and breadmaking quality. Journal of Cereal Science. 49 (1), 98-105 (2009).
- Limpert, E., Stahel, W. A., Abbt, M. Log-normal distributions across the sciences: keys and clues. Bioscience. 51 (5), 341-352 (2001).
- Gao, M., et al. Self-preserving lognormal volume-size distributions of starch granules in developing sweetpotatoes and modulation of their scale parameters by a starch synthase II (SSII). Acta Physiologiae Plantarum. 38 (11), 259 (2016).
- Wattebled, F., et al. STA11, a Chlamydomonas reinhardtii locus required for normal starch granule biogenesis, encodes disproportionating enzyme. Further evidence for a function of alpha-1,4 glucanotransferases during starch granule biosynthesis in green algae. Plant Physiology. 132 (1), 137-145 (2003).
- Ji, Y., Seetharaman, K., White, P. J. Optimizing a Small-Scale Corn-Starch Extraction Method for Use in the Laboratory. Cereal Chemistry. 81 (1), 55-58 (2004).
- Halloy, S., Whigham, P. The lognormal as universal descriptor of unconstrained complex systems: a unifying theory for complexity. Proceedings of the 7th Asia-Pacific Complex Systems Conference. , 309-320 (2004).
- Furusawa, C., Suzuki, T., Kashiwagi, A., Yomo, T., Kaneko, K. Ubiquity of log-normal distributions in intra-cellular reaction dynamics. Biophysics (Nagoya-shi). 1, 25-31 (2005).
