Analyse en specificatie van zetmeelgranulaatgrootteverdelingen
Summary
Hier wordt een procedure gepresenteerd voor reproduceerbare en statistisch geldige bepalingen van zetmeelgranulaatgrootteverdelingen en voor het specificeren van de bepaalde korrellognormale grootteverdelingen met behulp van een multiplicatieve vorm met twee parameters. Het is van toepassing op alle granulaatgrootteanalyses van zetmeelmonsters op gramschaal voor plant- en voedselwetenschappelijk onderzoek.
Abstract
Zetmeel uit alle plantaardige bronnen bestaat uit korrels in verschillende maten en vormen met verschillende frequenties, d.w.z. met een grootte en eenvormverdeling. Gegevens over de grootte van zetmeelkorrels die zijn bepaald met behulp van verschillende soorten deeltjesgroottetechnieken zijn vaak problematisch vanwege een slechte reproduceerbaarheid of gebrek aan statistische significantie als gevolg van enkele onoverkomelijke systematische fouten, waaronder gevoeligheid voor korrelvormen en limieten van korrelmonstergroottes. We hebben een procedure beschreven voor reproduceerbare en statistisch geldige bepalingen van zetmeelgranulaatgrootteverdelingen met behulp van de techniek van de elektrische detectiezone, en voor het specificeren van de bepaalde korrellognormale grootteverdelingen met behulp van een aangenomen multiplicatieve vorm met twee parameters met verbeterde nauwkeurigheid en vergelijkbaarheid. Het is van toepassing op alle granulaatgrootteanalyses van zetmeelmonsters op gramschaal en zou daarom studies kunnen vergemakkelijken over de manier waarop zetmeelkorrelgroottes worden gevormd door het zetmeelbiosyntheseapparaat en -mechanismen; en hoe ze eigenschappen en functionaliteit van zetmeel voor voedsel en industrieel gebruik beïnvloeden. Representatieve resultaten worden gepresenteerd uit repliceringsanalyses van granulaatgrootteverdelingen van sweetpotato-zetmeelmonsters volgens de geschetste procedure. We bespraken verder verschillende belangrijke technische aspecten van de procedure, met name de multiplicatieve specificatie van korrellognormale grootteverdelingen en enkele technische middelen om frequente diafragmablokkades door korrelaggregaten te overwinnen.
Introduction
Zetmeelkorrels zijn de fysische structuur waarin twee hoofdreserve homoglucan polymeren in plantenfotosynthese- en opslagweefsels, de lineaire of dun vertakte amylose en de sterk vertakte amylopectine, ordelijk zijn verpakt samen met enkele kleine componenten, waaronder lipiden en eiwitten. Zetmeelkorrels van verschillende plantensoorten vertonen veel driedimensionale (3D) vormen (herzien in ref.1,2), waaronder bollen, ellipsoïden, veelvlak, bloedplaatjes, kubussen, cuboids en onregelmatige tubuli. Zelfs die van hetzelfde weefsel of verschillende weefsels van dezelfde plantensoort kunnen een reeks vormen hebben met verschillende frequenties. Met andere woorden, zetmeelkorrels van een plantensoort kunnen een karakteristieke statistische vormverdeling hebben, in plaats van een specifieke vorm. De niet-uniforme en niet-bolvormige korrelvormen maken het moeilijk om zetmeelkorrelgroottes goed te meten en te definiëren. Bovendien zijn zetmeelkorrels uit dezelfde weefsels van een plantensoort van een reeks maten met verschillende verhoudingen, d.w.z. met een karakteristieke grootteverdeling. Deze grootteverdeling bemoeilijkt de analyse en beschrijving van zetmeelkorrelgroottes verder.
Zetmeelkorrelgroottes zijn geanalyseerd met behulp van verschillende categorieën deeltjesgroottetechnieken (herzien in ref.3),waaronder microscopie, sedimentatie/sterische veldstroomfractie (Sd/StFFF), laserdiffractie en elektrische detectiezone (ESZ). Deze technieken zijn echter niet even geschikt voor de bepaling van zetmeelkorrelgroottes in aanwezigheid van een korrelvorm en een grootteverdeling. Microscopie, inclusief lichte, confocale en scanning elektronenmicroscopie, is uitstekend geschikt voor de studies van morfologie4,5,6,7, structuur8,9 en ontwikkeling10,11 van zetmeelkorrels, maar nauwelijks geschikt voor het definiëren van hun grootteverdelingen vanwege enkele inherente tekortkomingen. directe metingen van microscopische korrelbeelden of softwareondersteunde beeldanalyse van optische microscopiegegevens (IAOM), die zijn gebruikt voor de bepaling van korrelgroottes zetmeel van verschillende soorten; met inbegrip van maïs12, tarwe13,14, aardappel15 en gerst16, kan alleen 1D (meestal maximale lengte) of 2D (oppervlakte) maten van zeer beperkte aantallen (tienduizenden) zetmeelkorrel afbeeldingen meten. De kleine korrelbemonsteringsgrootten die inherent door de technieken worden beperkt, kunnen zelden statistisch representatief zijn, gezien de enorme korrelgetallen per gewicht per eenheid zetmeel (~120 x 106 per gram, uitgaande van alle bollen van 10 μm bij een dichtheid van 1,5 g/cm³), en kunnen daarom leiden tot een slechte reproduceerbaarheid van de resultaten. De Sd/StFFF-techniek kan hoge snelheid en resolutie hebben, en smalle fracties van zetmeelkorrels17, maar is zelden gebruikt waarschijnlijk omdat de nauwkeurigheid ervan ernstig kan worden beïnvloed door beschadigingen, verschillende vormen en dichtheid van zetmeelkorrels. De laserdiffractietechniek is de meest gebruikte en is toegepast voor zetmeelgranulaatgrootteanalyses voor alle belangrijke gewassoorten3,14,16. Hoewel de techniek veel voordelen heeft, is het eigenlijk niet geschikt voor het bepalen van zetmeelkorrelgroottes in aanwezigheid van een korrelvormverdeling. De meeste gelijktijdige laserdiffractie-instrumenten vertrouwen op de Mie-lichtverstrooiingstheorie18 voor uniforme bolvormige deeltjes en de gemodificeerde Mie-theorie18 voor sommige andere vormen van uniformiteit. De techniek is daarom inherent zeer gevoelig voor deeltjesvormen en niet helemaal geschikt, zelfs niet voor bepaalde vormen van uniformiteit19, laat staan voor zetmeelkorrels met een reeks vormen van verschillende verhoudingen. De ESZ-techniek meet de elektrische veldstoring in verhouding tot het volume van het deeltje dat door een opening gaat. Het biedt korrelvolumegrootten, evenals de informatie over aantal- en volumeverdeling, enz., bij hoge resoluties. Aangezien de ESZ-techniek onafhankelijk is van optische eigenschappen van deeltjes, waaronder kleur, vorm, samenstelling of brekingsindex, en de resultaten zeer reproduceerbaar zijn, is het bijzonder geschikt voor het bepalen van grootteverdelingen van zetmeelkorrels met een reeks vormen.
Zetmeelkorrelgroottes zijn ook gedefinieerd met behulp van veel parameters. Ze werden vaak simplistisch beschreven door gemiddelde diameters, die in sommige gevallen de rekenkundige middelen waren van de microscopisch gemeten maximale lengtes van 2D-afbeeldingen12,20, of gemiddelden van equivalente boldiameters3. In andere gevallen werden de korrelgrootteverdelingen gespecificeerd aan de hand van groottebereiken21,22, het distributiegemiddelde volume of de gemiddelde diameter (bolequivalent, gewogen naar aantal, volume of oppervlakte) uitgaande van een normale verdeling14,23,24,25,26. Deze descriptoren van zetmeelkorrelgroottes uit verschillende analyses zijn van een heel andere aard en niet strikt vergelijkbaar. Het kan zeer misleidend zijn als deze “maten” zetmeelkorrels van verschillende soorten of zelfs dezelfde weefsels van dezelfde soort rechtstreeks worden vergeleken. Bovendien is de spreidingsparameter (of vorm) van de veronderstelde normale verdelingen, d.w.z. de standaardafwijking σ (of grafische standaardafwijking σg)die de breedte van de verdeling meet (d.w.z. de spreiding van de afmetingen), in de meeste studies genegeerd.
Om de bovengenoemde kritieke problemen op te lossen waarmee zetmeelkorrelgrootteanalyses worden geconfronteerd, hebben we een procedure beschreven voor reproduceerbare en statistisch geldige bepaling van korrelgrootteverdelingen van zetmeelmonsters met behulp van de ESZ-techniek, en voor het correct specificeren van de vastgestelde korrellognormale grootteverdelingen met behulp van een aangenomen multiplicatieve vorm met twee parameters27 met verbeterde nauwkeurigheid en vergelijkbaarheid. Voor validatie en demonstratie hebben we replicerende granulaatmaatanalyses van sweetpotato zetmeelmonsters uitgevoerd met behulp van de procedure en de lognormale differentiële volume-percentage volume-equivalente-boldiameterverdelingen gespecificeerd met behulp van hun grafische geometrische middelen 
en multiplicatieve standaardafwijkingen s* in een x/ (vermenigvuldigen en delen) s* vorm.
Protocol
Representative Results
Discussion
De geschetste procedure heeft een aantal kritieke problemen opgelost in verschillende bestaande methoden voor zetmeelgranulaatgrootteanalyses, waaronder ongepaste 1D- of 2D-dimensionering van 3D-korrels, vervorming van maatmetingen als gevolg van niet-uniforme korrelvormen, slechte reproduceerbaarheid en dubieuze statistische validiteit als gevolg van beperkte korrelmonstergroottes, onnauwkeurige of onjuiste specificatie (met name het gebruik van de gemiddelde grootte) van korrelgroottes in aanwezigheid van zowel korrelv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt deels ondersteund door het Cooperative Agriculture Research Center en Integrated Food Security Research Center van het College of Agriculture and Human Sciences, Prairie View A&M University. We danken Hua Tian voor zijn technische ondersteuning.
Materials
| Analytical beaker | Beckman Coulter Life Sciences | A35595 | Smart-Technology (ST) beaker |
| Aperture tube, 100 µm | Beckman Coulter Life Sciences | A36394 | For the MS4E, , 1000 µm |
| Disposable transfer pipettor, | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 13-711-9AM | Other disposable transfer pipettors with similar orifice can also be used. |
| Fisherbrand Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50 ml | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 05-539-13 | Any other similar types of tubes can be used. |
| Glass beakers, 150 to 250 ml | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 02-540K | These beakers are used to contain methanol for washing the aperture tube and stirer between runs. |
| LiCl | Fisher Chemical | L121-100 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A412-500 | Buy in bulk as the analysis uses a large quantity of methanol. |
| Mettler Toledo ML-T Precision Balances | Mettler Toledo | 30243412 | Any other precision balance with a readablity 0.01 g to 1 mg will work. |
| Multisizer 4e Coulter Counter | Beckman Coulter Life Sciences | B23005 | The old model, Multisizer 3 can also be used with slight adjustment of parameters. The 4e model comes with a 100 μm aperture tube. Other aperture tubes of different diameter can be purchased separately from the company. |
| Ultrasonic processor UP50H | Hielscher Ultrasound Technology | UP50H | Other laborator sonicator having a low-power (<50 Watt) output can be also used. Both MS1 and MS2 sonotrodes for the particular sonicator can be used to disperse starch granules in 5 ml methanol. Always use the lowest setting first, 20% amplitude and 0.1 or 0.2 cycle, and raise the setting if aggregates persist in suspension. |
References
- Shannon, J. C., Garwood, D. L., Boyer, C. D., BeMiller, J., Whistler, R. . Starch:Chemistry and Technology Food Science and Technology. , 23-82 (2009).
- Singh, N., Singh, J., Kaur, L., Singh Sodhi, N., Singh Gill, B. Morphological, thermal and rheological properties of starches from different botanical sources. Food Chemistry. 81 (2), 219-231 (2003).
- Lindeboom, N., Chang, P. R., Tyler, R. T. Analytical, biochemical and physicochemical aspects of starch granule size, with emphasis on small granule starches: a review. Starch – Stärke. 56 (34), 89-99 (2004).
- Baldwin, P. M., Davies, M. C., Melia, C. D. Starch granule surface imaging using low-voltage scanning electron microscopy and atomic force microscopy. International Journal of Biological Macromolecules. 21 (1-2), 103-107 (1997).
- Jane, J. L., Kasemsuwan, T., Leas, S., Zobel, H., Robyt, J. F. Anthology of starch granule morphology by scanning electron microscopy. Starch-Stärke. 46 (4), 121-129 (1994).
- Matsushima, R., Nakamura, Y. . Starch: Metabolism and Structure. , 425-441 (2015).
- Wang, S. -. q., Wanf, L. -. l., Fan, W. -. h., Cao, H., Cao, B. -. s. Morphological analysis of common edible starch granules by scanning electron microscopy. Food Science. 32 (15), 74-79 (2011).
- Baldwin, P. M., Adler, J., Davies, M. C., Melia, C. D. Holes in starch granules: confocal, SEM and light microscopy studies of starch granule structure. Starch-Stärke. 46 (9), 341-346 (1994).
- Chakraborty, I., Pallen, S., Shetty, Y., Roy, N., Mazumder, N. Advanced microscopy techniques for revealing molecular structure of starch granules. Biophysical Reviews. 12 (1), 105-122 (2020).
- Bechtel, D. B., Wilson, J. D. Amyloplast formation and starch granule development in hard red winter wheat. Cereal Chemistry. 80 (2), 175-183 (2003).
- Evers, A. Scanning electron microscopy of wheat starch. III. Granule development in the endosperm. Starch-Stärke. 23 (5), 157-162 (1971).
- Wang, Y. J., White, P., Pollak, L., Jane, J. L. Characterization of starch structures of 17 maize endosperm mutant genotypes with Oh43 inbred line background. Cereal Chemistry. 70, 171-179 (1993).
- Peng, M., Gao, M., Abdel-Aal, E. S. M., Hucl, P., Chibbar, R. N. Separation and characterization of A-and B-type starch granules in wheat endosperm. Cereal Chemistry. 76, 375-379 (1999).
- Wilson, J. D., Bechtel, D. B., Todd, T. C., Seib, P. A. Measurement of wheat starch granule size distribution using image analysis and laser diffraction technology. Cereal Chemistry. 83 (3), 259-268 (2006).
- Liu, Q., Weber, E., Currie, V., Yada, R. Physicochemical properties of starches during potato growth. Carbohydrate Polymers. 51 (2), 213-221 (2003).
- Chmelik, J., et al. Comparison of size characterization of barley starch granules determined by electron and optical microscopy, low angle laser light scattering and gravitational field-flow fractionation. Journal of the Institute of Brewing. 107 (1), 11-17 (2001).
- Moon, M. H., Giddings, J. C. Rapid separation and measurement of particle size distribution of starch granules by sedimentation/steric field-flow fractionation. Journal of Food Science. 58 (5), 1166-1171 (1993).
- Wriedt, T., Wolfram, H., Wriedt, T. . The Mie Theory: Basics and Applications. , 53-71 (2012).
- Schuerman, D. W., Wang, R. T., Gustafson, B. &. #. 1. 9. 7. ;. S., Schaefer, R. W. Systematic studies of light scattering. 1: Particle shape. Applied Optics. 20 (23), 4039-4050 (1981).
- Goering, K. J., Fritts, D. H., Eslick, R. F. A study of starch granule size and distribution in 29 barley varieties. Starch-Stärke. 25 (9), 297-302 (1973).
- Chen, Z., Schols, H. A., Voragen, A. G. J. Starch granule size strongly determines starch noodle processing and noodle quality. Journal of Food Sciences. 68 (5), 1584-1589 (2003).
- Dai, Z. M. Starch granule size distribution in grains at different positions on the spike of wheat (Triticum aestivum L.). Starch-Starke. 61 (10), 582-589 (2009).
- Edwards, M. A., Osborne, B. G., Henry, R. J. Effect of endosperm starch granule size distribution on milling yield in hard wheat. Journal of Cereal Science. 48 (1), 180-192 (2008).
- Karlsson, R., Olered, R., Eliasson, A. C. Changes in starch granule size distribution and starch gelatinization properties during development and maturation of wheat, barley and rye. Starch – Starke. 35 (10), 335-340 (1983).
- Li, W. -. Y., et al. Comparison of starch granule size distribution between hard and soft wheat cultivars in Eastern China. Agricultural Sciences China. 7 (8), 907-914 (2008).
- Park, S. H., Wilson, J. D., Seabourn, B. W. Starch granule size distribution of hard red winter and hard red spring wheat: Its effects on mixing and breadmaking quality. Journal of Cereal Science. 49 (1), 98-105 (2009).
- Limpert, E., Stahel, W. A., Abbt, M. Log-normal distributions across the sciences: keys and clues. Bioscience. 51 (5), 341-352 (2001).
- Gao, M., et al. Self-preserving lognormal volume-size distributions of starch granules in developing sweetpotatoes and modulation of their scale parameters by a starch synthase II (SSII). Acta Physiologiae Plantarum. 38 (11), 259 (2016).
- Wattebled, F., et al. STA11, a Chlamydomonas reinhardtii locus required for normal starch granule biogenesis, encodes disproportionating enzyme. Further evidence for a function of alpha-1,4 glucanotransferases during starch granule biosynthesis in green algae. Plant Physiology. 132 (1), 137-145 (2003).
- Ji, Y., Seetharaman, K., White, P. J. Optimizing a Small-Scale Corn-Starch Extraction Method for Use in the Laboratory. Cereal Chemistry. 81 (1), 55-58 (2004).
- Halloy, S., Whigham, P. The lognormal as universal descriptor of unconstrained complex systems: a unifying theory for complexity. Proceedings of the 7th Asia-Pacific Complex Systems Conference. , 309-320 (2004).
- Furusawa, C., Suzuki, T., Kashiwagi, A., Yomo, T., Kaneko, K. Ubiquity of log-normal distributions in intra-cellular reaction dynamics. Biophysics (Nagoya-shi). 1, 25-31 (2005).
