Análisis y especificación de distribuciones de tamaño de gránulo de almidón

Los gránulos de almidón son la estructura física en la que dos polímeros homoglucanos de reserva principal en la fotosíntesis vegetal y los tejidos de almacenamiento, la amilosa lineal o escasamente ramificada y la amiloidpectina altamente ramificada, están embalados ordenadamente junto con algunos componentes menores, incluyendo lípidos y proteínas. Los gránulos de almidón de varias especies vegetales exhiben muchas formas tridimensionales (3D) (revisadas en los puntos^1,2),incluyendo esferas, elipsoides, poliedro, plaquetas, cubos, cuboides y túbulos irregulares. Incluso aquellos del mismo tejido o diferentes tejidos de la misma especie vegetal podrían tener un conjunto de formas con diferentes frecuencias de ocurrencia. En otras palabras, los gránulos de almidón de una especie vegetal pueden tener una distribución característica de la forma estadística, en lugar de una forma específica. Las formas de gránulos no uniformes y no esféricos hacen que sea difícil medir y definir correctamente los tamaños de gránulos de almidón. Además, los gránulos de almidón de los mismos tejidos de una especie vegetal son de una gama de tamaños con diferentes proporciones, es decir, exhibiendo una distribución de tamaño característica. Esta distribución del tamaño complica aún más el análisis y la descripción de los tamaños de gránulos de almidón.

Los tamaños de gránulos de almidón se han analizado utilizando varias categorías de técnicas de dimensionamiento de partículas (revisadas en la referencia^3),incluyendo microscopía, sedimentación/fraccionamiento de flujo de campo estetérico (Sd/StFFF), difracción láser y zona de detección eléctrica (ESZ). Sin embargo, estas técnicas no son igualmente adecuadas para la determinación de tamaños de gránulos de almidón en presencia de una forma de gránulo y una distribución de tamaño. La microscopía, incluyendo microscopía electrónica ligera, confocal y de barrido, es excelente para los estudios de morfología^4,5,6,7,estructura^8,9 y desarrollo^10,11 de gránulos de almidón, pero difícilmente adecuado para definir sus distribuciones de tamaño debido a algunas deficiencias inherentes. Mediciones directas de imágenes microscópicas de gránulos o análisis de imágenes asistidas por software de datos de microscopía óptica (IAOM), que se han utilizado para la determinación de tamaños de gránulos de almidones de varias especies, incluyendo maíz^12,trigo^13,14,papa¹⁵ y cebada^16,puede medir sólo 1D (generalmente longitud máxima) o 2D (superficie) tamaños de números muy limitados (decenas a unos pocos miles) de imágenes de gránulos de almidón. Los pequeños tamaños de muestreo de gránulos que están inherentemente limitados por las técnicas rara vez podrían ser estadísticamente representativos, teniendo en cuenta los enormes números de gránulos por unidad de peso de almidón (~ 120 x 10⁶ por gramo, asumiendo todas las esferas de 10 μm a 1,5 g/cm³ de densidad), y, por lo tanto, podría conducir a la mala reproducibilidad de los resultados. La técnica Sd/StFFF puede tener alta velocidad y resolución, y fracciones de tamaño estrecho de gránulos de almidón^17,pero rara vez se ha utilizado probablemente porque su precisión podría verse gravemente afectada por daños, diferentes formas y densidad de gránulos de almidón. La técnica de difracción láser es la más utilizada, y se ha aplicado para análisis del tamaño del gránulo de almidón para todas las especies de cultivos principales^3,14,16. Aunque la técnica tiene muchas ventajas, en realidad no es adecuada para determinaciones de tamaños de gránulos de almidón en presencia de una distribución de forma de gránulo. La mayoría de los instrumentos de difracción láser concurrentes se basan en la teoría de dispersión de luz Mie¹⁸ para partículas esféricas uniformes y la teoría mie modificada¹⁸ para algunas otras formas de uniformidad. La técnica es, por lo tanto, inherentemente muy sensible a las formas de partículas, y no es del todo adecuada incluso para ciertas formas de uniformidad^19,y mucho menos para los gránulos de almidón que tienen un conjunto de formas de diferentes proporciones. La técnica ESZ mide la perturbación del campo eléctrico proporcional al volumen de la partícula que pasa a través de una abertura. Proporciona tamaños de volumen de gránulos, así como la información de distribución de número y volumen, etc., a altas resoluciones. Dado que la técnica ESZ es independiente de cualquier propiedad óptica de partículas como el color, la forma, la composición o el índice refractario, y los resultados son muy reproducibles, es particularmente adecuado para determinar las distribuciones de tamaño de los gránulos de almidón que tienen un conjunto de formas.

Los tamaños de gránulo de almidón también se han definido mediante el uso de muchos parámetros. A menudo fueron descritos simplistamente por diámetros medios, que en algunos casos eran los medios aritméticos de las longitudes máximas microscópicamente medidas de imágenes 2D^12,20, o promedios de diámetros de esfera equivalentes³. En otros casos, las distribuciones de tamaño de gránulo se especificaron utilizando rangos de tamaño^21,22, el volumen medio de distribución o diámetro medio (equivalente a esfera, ponderado por número, volumen o superficie) suponiendo una distribución normal^{14,23,24,25,26}. Estos descriptores de tamaños de gránulos de almidón de varios análisis son de una naturaleza muy diferente, y no estrictamente comparables. Podría ser muy engañoso si estos “tamaños” de gránulos de almidón de diferentes especies o incluso los mismos tejidos de la misma especie fueran comparados directamente. Además, el parámetro de dispersión (o forma) de las distribuciones normales asumidas, es decir, la desviación estándar σ (o desviación estándar gráfica σ_g)que mide el ancho de la distribución (es decir, la dispersión de los tamaños), se ha ignorado en la mayoría de los estudios.

Para resolver los problemas críticos antes mencionados que enfrentan los análisis de tamaño de gránulos de almidón, delineamos un procedimiento para determinar reproducibles y estadísticamente válidos las distribuciones de tamaño de gránulo de muestras de almidón utilizando la técnica ESZ, y para especificar correctamente las distribuciones de tamaño lognormal de gránulos determinadas utilizando una forma multiplicativa de dos parámetros adoptada²⁷ con mayor precisión y comparabilidad. Para la validación y demostración, realizamos análisis de tamaño de gránulo de réplica de muestras de almidón de camote utilizando el procedimiento, y especificamos las distribuciones de volumen diferencial lognormal de volumen-volumen equivalente-esfera de diámetro utilizando sus medios geométricos gráficos y desviaciones estándar multiplicativas s* en una forma ^x/ (multiplicar y dividir).