تقليل نقص الأكسجة في شرائح فرس النهر من الكبار والشيخوخة الفئران

وقد سهل ظهور الثدييات الاستعدادات شريحة الدماغ الحادة التجارب على المستوى الخلوية والتشابكية التي كانت ممكنة سابقا إلا في الاستعدادات اللافقارية مثل Aplysia¹. وكان تطوير شرائح فرس النهر الحادة ذات أهمية خاصة، حيث أنها هيكل مسؤول عن تكوين الذاكرة والعمل والسياق، ولها دوائر ثلاثية متشابك متخصصة قابلة للتلاعب الفسيولوجي السهل. ومع ذلك ، فإن الغالبية العظمى من شرائح الدماغ الحادة لا تزال مستعدة من الفئران والجرذان الصغيرة نسبيا ، حيث أنه من الأسهل الحفاظ على الخلايا العصبية والدوائر الصحية ، وتبقى الشرائح قابلة للحياة لفترات أطول من الزمن^2،3،4. هنا، نقدم تعديلات على بروتوكولات التقطيع القياسية التي تؤدي إلى زيادة جدوى شرائح قرن آمون الحادة من الفئران البالغة والشيخوخة.

العائق الرئيسي أمام قدرة الجسم الحي السابق على البقاء على المدى الطويل من الثديات الدماغ parenchyma هو الضرر hypoxic الأولية التي تحدث بسرعة بمجرد تدفق الدم إلى الدماغ يتوقف بعد قطع الرأس. فقدان الأكسجين النتائج في الاستهلاك الأيضي السريع من موارد الطاقة الرئيسية في الدماغ مع فقدان فوسفو الكرياتين (ف- الكرياتين) كونها أسرع، تليها الجلوكوز، الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)، والجليكوجين⁴. الحفاظ على ATP له أهمية خاصة لصحة طويلة الأجل لشرائح الدماغ، كما هو مطلوب ATP للحفاظ على إمكانات الغشاء عبر ATPase نا-K، وبالتالي النشاط العصبي^5،,6. مستوى ATP في الدماغ القوارض الكبار هو ~ 2.5 mM، ويسقط بشكل حاد داخل 20 ق من قطع الرأس للوصول إلى حالة ثابتة القاعدية (~ 0.5 mM) في حوالي 1 دقيقة بعد قطع الرأس^4،7،8. في الحيوانات الصغيرة، يستغرق وقتا أطول لمراقبة نفس الانخفاض في ATP (~ 2 دقيقة)؛ مع التخدير الفينوباربيالي هو مزيد من تباطؤ إلى 4 دقيقة⁴. وتبين هذه الاعتبارات أن منع فقدان ATP وغيرها من موارد الطاقة هو استراتيجية ضرورية لمنع تلف نقص الأكسجة في الدماغ، وبدوره للحفاظ على صحة شرائح الدماغ على مدى فترات أطول من الزمن، وخاصة في الحيوانات البالغة.

انخفاض درجات الحرارة تبطئ عملية التمثيل الغذائي. وبالتالي، فقد ثبت أن انخفاض حرارة الجسم متواضعة يحمي احتياطيات الطاقة في الدماغ: في الحيوانات الصغيرة، وخفض درجة حرارة الجسم بمقدار ست درجات، من 37 درجة مئوية إلى 31 درجة مئوية، يحافظ على مستويات ATP إلى حوالي 80٪ من المستويات العادية على مدى 4 ساعة من نقص الأكسجة الخاضعة للرقابة⁹. كما يتم الحفاظ على مستويات P-الكرياتين، وكذلك احتمالية الفسفور الشامل⁹. وهذا يشير إلى أن خفض درجة حرارة الجسم قبل قطع الرأس يمكن أن يكون عصبيا، حيث يمكن الحفاظ على مستويات شبه طبيعية من ATP من خلال قطع شريحة وشريحة فترات الانتعاش.

إلى درجة أن قطرة ATP لا يمكن منعها تماما عند قطع الرأس، ومن المتوقع وظيفة ضعف جزئي من ATPase نا- K، تليها إزالة التلوث عن طريق تدفق الصوديوم السلبي. كما يتبع تدفق الصوديوم السلبي من خلال دخول المياه إلى الخلايا، فإنه يسبب وذمة السامة للخلايا وفي نهاية المطاف pyknosis. في الفئران البالغة، استبدال نا + الأيونات مع السكروز في حلول قطع شريحة كانت استراتيجية ناجحة لتخفيف عبء الوذمة السامة للخلايا^10،11. في الآونة الأخيرة، وقد أظهرت الكاتيونات العضوية الميثيلية التي تقلل نفاذية قناة الصوديوم¹² لتقديم حماية أكثر فعالية من السكروز، وخاصة في شرائح من الفئران الكبار، مع N-الميثيل-D-جلوكوامين (NMDG) يجري الأكثر انطباقا على نطاق واسع عبر مختلف الأعمار ومناطق الدماغ^{13،14،15،16}.

العديد من بروتوكولات تشريح الدماغ تنطوي على استخدام درجات الحرارة الباردة فقط خلال خطوة قطع شريحة، وأحيانا في تركيبة مع نا⁺ استراتيجية استبدال الأيونات^16،17. في الحيوانات الصغيرة ، يبدو أن هذه البروتوكولات توفر الحماية العصبية الكافية حيث يمكن استخراج الأدمغة بسرعة بعد قطع الرأس لأن الجمجمة لا تزال رقيقة وسهلة لإزالة^3. ومع ذلك، هذه الاستراتيجية لا تنتج شرائح صحية من الحيوانات البالغة. مع مرور الوقت، أدخلت عدد من المختبرات التي تدرس القوارض البالغة الضخ عبر القلب مع محلول الجليد البارد لخفض درجة حرارة جسم الحيوان، وبالتالي تلف نقص الأكسجة في الدماغ، قبل قطع الرأس. تم تطبيق هذا الإجراء بنجاح لإنتاج شرائح cerebellar¹⁸، شرائح midbrain¹⁹، شرائح القشرة الجديدة^11،20، القشرة الرحاين²¹، قرن آمون الفئران^10،22،23، لمبة الشم²⁴، المخطط البطيني²⁵، القشرة البصرية²⁶.

على الرغم من المزايا التي يوفرها الضخ عبر القلب وNa⁺ استبدال الأيونات في إعداد شرائح من الفئران وفي بعض مناطق الدماغ في الفئران، يبقى قرن الماوس قرن آمين واحدة من أكثر المناطق تحديا للحماية من نقص الأكسجة^13،20. حتى الآن، واحدة من النهج الأكثر شيوعا لشرائح قرن آمون من الفئران الشيخوخة ونماذج الماوس من الانعزال العصبي ينطوي على تشريح سريع الكلاسيكية من فرس النهر المعزول²⁷. في البروتوكول الموصوف هنا ، نحن نقلل من فقدان ATP في الدماغ البالغ من خلال إدخال انخفاض حرارة الجسم قبل قطع الرأس عن طريق ضخ الحيوان عبر القلب مع الثلج البارد Na⁺– السائل النخاعي الاصطناعي المجاني NMDG القائم على NMDG (NMDG-aCSF). ثم يتم قطع شرائح في الجليد الباردة نا⁺-خالية NMDG-aCSF. مع هذا البروتوكول المعزز نحصل على شرائح قرن آمون حادة من الفئران البالغة والشيخوخة التي هي صحية لمدة تصل إلى 10 ساعة بعد التقطيع ومناسبة لتسجيلات ميدانية طويلة الأجل ودراسات التصحيح المشبك.