Минимизация гипоксии в гиппокампе ломтики от взрослых и старения мышей

Появление млекопитающих острых препаратов кусок мозга способствовали эксперименты на клеточном и синаптическом уровне, которые ранее были возможны только в беспозвоночных препаратов, как Аплизия¹. Особое значение имеет развитие острых ломтиков гиппокампа, так как это структура, отвечающая за рабочую память и контекстообразование, и имеет специализированную трехсинаптическую схему, которая поддается легкой физиологической манипуляции. Тем не менее, подавляющее большинство острых ломтиков мозга по-прежнему готовятся из относительно молодых мышей и крыс, так как легче сохранить здоровые нейроны и схемы, и ломтики остаются жизнеспособными в течение более длительных периодов^{времени 2,3,4}. Здесь мы вводим изменения в стандартные протоколы нарезки, которые приводят к повышению жизнеспособности острых ломтиков гиппокампа от взрослых и стареющих мышей.

Основным препятствием для долгосрочной ex vivo жизнеспособности млекопитающих мозга parenchyma является первоначальный гипоксический ущерб, который происходит быстро, как только поток крови к мозгу останавливается после обезглавливания. Потеря кислорода приводит к быстрому метаболическому потреблению основных энергетических ресурсов в головном мозге с потерей фосфо-креатина (P-креатина) является наиболее быстрым, а затем глюкозы, аденозинтрифосфата (АТФ), и гликоген⁴. Сохранение АТФ имеет особое значение для долгосрочного здоровья ломтиков мозга, так как АТФ необходим для поддержания мембранного потенциала через Na-K ATPase, и, следовательно, нейронной активности^5,6. Уровень АТФ в мозге взрослого грызуна составляет 2,5 мМ, и он резко падает в пределах 20 с обезглавливания, чтобы достичь базального устойчивого состояния (0,5 мМ) на уровне около 1 мин после обезглавливания^4,7,8. У молодых животных, это занимает больше времени, чтобы наблюдать то же падение в АТФ (2 мин); с фенобарбитальной анестезией он далее замедлился до 4 мин⁴. Эти соображения показывают, что предотвращение потери АТФ и других энергетических ресурсов является необходимой стратегией для предотвращения гипоксического повреждения мозга и, в свою очередь, для поддержания здоровья ломтиков мозга в течение более длительных периодов времени, особенно у взрослых животных.

Низкие температуры замедляют обмен веществ. Следовательно, было продемонстрировано, что скромное переохлаждение защищает запасы энергии мозга: у молодых животных, снижая температуру тела на шесть градусов, с 37 градусов до 31 градусов по Цельсию, сохраняет уровни АТФ примерно до 80% от нормального уровня более 4 ч контролируемой гипоксии⁹. Уровни P-креатина также сохранены, также, как общий потенциал фосфорилирования^9. Это говорит о том, что снижение температуры тела до обезглавливания может быть нейропротекторным, так как почти нормальные уровни АТФ могут поддерживаться через ломтик резки и ломтик периодов восстановления.

В той степени, что падение АТФ не может быть полностью предотвращено при обезглавливании, ожидается частично нарушенная функция Na-K ATPase, за которой последует деполяризация через пассивный приток натрия. Как пассивный приток натрия сопровождается водой вступления в клетки, он вызывает цитотоксический отек и в конечном итоге пикноз. У взрослых крыс, замена ионов Na’ с сахарозой в срез-резки решений была успешная стратегия, чтобы облегчить бремя цитотоксического отека^10,11. Совсем недавно, метилированные органические катиции, которые уменьшают проницаемость канала натрия¹² показали, чтобы предложить более эффективную защиту, чем сахароза, особенно в ломтики от взрослых мышей, с N-метил-D-глюкамин (NMDG) наиболее широко применимы в разных возрастов и мозговых регионах^13,14,15,16.

Многочисленные протоколы нарезки мозга включают использование холодных температур только во время срезающего шага, иногда в сочетании со стратегией замены иона Na^{й 16,17}. У молодых животных, эти протоколы, как представляется, предлагают достаточно нейрозащиты, так как мозг может быть извлечен быстро после обезглавливания, потому что череп все еще тонкий и легко удалить³. Тем не менее, эта стратегия не производит здоровые ломтики от взрослых животных. Со временем в ряде лабораторий, изучающих взрослых грызунов, введена транскардиальная перфузия с ледяным раствором для снижения температуры тела животного и, следовательно, гипоксического повреждения мозга до обезглавливания. Эта процедура была успешно применена для производства мозжечковых ломтиков^18,ломтики среднего мозга¹⁹, неокортиковые ломтики^11,20, периринальной коры²¹, крыса гиппокампа^10,22,^23,обонятельная луковица²⁴, вентральная стриятная тум²⁵, визуальная кора²⁶.

Несмотря на преимущества, предлагаемые транскардиальной перфузии и Na^ион замены в подготовке ломтиков от крысы и в некоторых областях мозга у мышей, мышь гиппокампа остается одним из самых сложных областей для защиты от гипоксии^13,20. На сегодняшний день, один из наиболее распространенных подходов к нарезке гиппокампа от старения мышей и мыши модели нейродегенерации включает в себя классические быстро нарезки изолированных гиппокампа²⁷. В протоколе, описанном здесь, мы минимизируем потерю АТФ во взрослом мозгу, вводя переохлаждение до обезглавливания путем транскардиальной перфузии животного с ледяной^Na– свободной NMDG основе искусственной спинномозговой жидкости (NMDG-aCSF). Ломтики затем вырезать в ледяной Na^{–бесплатно}NMDG-aCSF. С помощью этого расширенного протокола мы получаем острые ломтики гиппокампа от взрослых и стареющих мышей, которые здоровы до 10 ч после нарезки и подходят для долгосрочных полевых записей и патч-зажим исследований.