Het minimaliseren van Hypoxie in Hippocampal Slices van volwassen en oudere muizen

De komst van zoogdier acute hersenen slice preparaten vergemakkelijkt experimenten op cellulair en synaptisch niveau die voorheen alleen mogelijk waren in ongewervelde preparaten zoals Aplysia¹. Ontwikkeling van acute hippocampal plakjes was van bijzonder belang, want het is een structuur die verantwoordelijk is voor het werkgeheugen en contextvorming, en heeft een gespecialiseerde tri-synaptische circuits die vatbaar is voor eenvoudige fysiologische manipulatie. Echter, de overgrote meerderheid van de acute hersenen plakjes zijn nog steeds bereid van relatief jonge muizen en ratten, want het is gemakkelijker om gezonde neuronen en circuits te behouden, en de plakjes levensvatbaar blijven voor langere tijd^2,3,4. Hier introduceren we wijzigingen in standaard snijprotocollen die resulteren in een verhoogde levensvatbaarheid van acute hippocampale plakjes van volwassen en oudere muizen.

De belangrijkste belemmering voor de lange termijn ex vivo levensvatbaarheid van zoogdier hersenen parenchyma is de eerste hypoxische schade die snel optreedt zodra de bloedtoevoer naar de hersenen stopt na onthoofding. Verlies van zuurstof resulteert in een snelle metabole consumptie van belangrijke energiebronnen in de hersenen met het verlies van fosfo-creatine (P-creatine) is de snelste, gevolgd door glucose, adenosine triphosfate (ATP), en glycogeen⁴. Behoud van ATP is van bijzonder belang voor de gezondheid op lange termijn van de hersenen plakjes, zoals ATP nodig is om het membraan potentieel te behouden via de Na-K ATPase, en dus de neurale activiteit^5,6. Het ATP-niveau in het volwassen knaagdierbrein is ~2,5 mM, en het daalt snel binnen 20 s van onthoofding om een basale steady state (~0,5 mM) te bereiken op ongeveer 1 min na de onthoofding^4,7,8. Bij jonge dieren duurt het langer om dezelfde daling van de ATP (~ 2 min) waar te nemen; met fenobarbital anesthesie wordt het verder vertraagd tot 4 min⁴. Deze overwegingen tonen aan dat het voorkomen van verlies van ATP en andere energiebronnen is een noodzakelijke strategie om hypoxische schade aan de hersenen te voorkomen en op zijn beurt om de gezondheid van de hersenen plakjes te handhaven over langere perioden van tijd, vooral bij volwassen dieren.

Lage temperaturen vertragen de stofwisseling. Bijgevolg is aangetoond dat bescheiden onderkoeling de energiereserves van de hersenen beschermt: bij jonge dieren, waarbij de lichaamstemperatuur met zes graden wordt verlaagd, van 37 °C tot 31 °C, behoudt atp-niveaus tot ongeveer 80% van de normale niveaus meer dan 4 uur van gecontroleerde hypoxie⁹. P-creatine niveaus zijn eveneens bewaard gebleven, evenals de totale fosforylatie potentieel⁹. Dit suggereert dat het verlagen van de lichaamstemperatuur voorafgaand aan onthoofding neuroprotectieve zou kunnen zijn, als bijna-normale niveaus van ATP kan worden gehandhaafd door de slice snijden en slice herstel periodes.

In de mate dat een ATP-daling bij onthoofding niet volledig kan worden voorkomen, wordt een gedeeltelijk verminderde functie van de Na-K ATPase verwacht, gevolgd door depolarisatie via passieve natriuminstroom. Als de passieve natrium instroom wordt gevolgd door water binnenkomst in cellen, het veroorzaakt cytotoxisch oedeem en uiteindelijk pyknosis. Bij volwassen ratten is het vervangen van Na+ ionen door sacharose in slice-cutting oplossingen een succesvolle strategie geweest om de last van cytotoxisch oedeem^10,11te verlichten . Meer recentelijk hebben gemethyleerde organische kations die de doorlaatbaarheid van natriumkanaal verminderen^12, aangetoond dat ze een effectievere bescherming bieden dan sacharose, vooral in plakjes van volwassen muizen, waarbij N-methyl-D-glucamine (NMDG) het meest van toepassing is in verschillende leeftijden en hersengebieden^13,14,15,16.

Tal van brein-snijden protocollen betrekken het gebruik van koude temperaturen alleen tijdens de slice-cutting stap, soms in combinatie met Na⁺ ionvervanging strategie^16,17. Bij jonge dieren lijken deze protocollen voldoende neuroprotectie te bieden, omdat de hersenen snel na onthoofding kunnen worden geëxtraheerd omdat de schedel nog dun is en gemakkelijk te verwijderen³. Deze strategie produceert echter geen gezonde plakjes van volwassen dieren. Na verloop van tijd hebben een aantal laboratoria die volwassen knaagdieren bestuderen transcardiale perfusie geïntroduceerd met een ijskoude oplossing om de lichaamstemperatuur van het dier te verlagen, en dus hypoxische schade aan de hersenen, voorafgaand aan onthoofding. Deze procedure werd met succes toegepast op de productie van cerebellar plakjes¹⁸, midbrain plakjes¹⁹, neocorticale plakjes^11,20, perirhinale cortex²¹, rat hippocampus^10,22,23, reukbol²⁴, ventrale striatum²⁵, visuele cortex²⁶.

Ondanks de voordelen die transcardiale perfusie en Na⁺ ionenvervanging bieden bij het bereiden van plakjes ratten en in sommige hersengebieden bij muizen, blijft muis hippocampus een van de meest uitdagende gebieden om te beschermen tegen hypoxie^13,20. Tot op heden, een van de meest voorkomende benaderingen voor het snijden hippocampus van veroudering muizen en muis modellen van neurodegeneratie omvat de klassieke snelle snijden van de geïsoleerde hippocampi²⁷. In het hier beschreven protocol minimaliseren we het verlies van ATP in de volwassen hersenen door onderkoeling te introduceren voorafgaand aan de onthoofding door het dier transcardieel te doorbrengen met ijskoude Na⁺– gratis op NMDG gebaseerde kunstmatige hersenvocht (NMDG-aCSF). Plakjes worden vervolgens gesneden in ijskoude Na⁺-vrije NMDG-aCSF. Met dit verbeterde protocol verkrijgen we acute hippocampal plakjes van volwassen en oudere muizen die gezond zijn voor maximaal 10 uur na het snijden en geschikt zijn voor lange termijn veldopnames en patch-clamp studies.