이 프로토콜은 구조 수준에서 M42 아미노펩티다아제인 TmPep1050의 디머-도데카메르 전환을 연구하기 위해 개발되었다. 단백질 정제에서 X선 데이터 처리에 이르기까지 간단한 파이프라인입니다. 결정발생, 데이터 세트 인덱싱 및 분자 교체는 연구의 경우, TmPep1050H60A H307A 변이체를 통해 강조되었다.
M42 아미노펩티다스는 12개의 서브유닛으로 이루어진 기능활성 복합체를 형성한다. 그들의 조립 과정은 이머 도데카메르 전환을 유발하는 금속 이온 공동 인자에 의해 규제되는 것으로 보입니다. 금속 이온 바인딩시 활성 부위및 상호 작용 인터페이스에서 여러 가지 구조적 수정이 발생하여 자체 조립을 촉진하기 위해 희미한 모양을 형성합니다. 이러한 수정을 관찰하려면 구조 연구 전에 안정적인 올리고머를 분리해야 합니다. 여기에 보고된 TmPep1050의 안정적인 도데카머와 디머, T. 마리티마의M42 아미노펩티다아제, X선 결정학에 의한 구조 결정의 정화를 허용하는 방법이다. 디머는 킬링 에이전트로 금속 이온을 제거하여 도데카머로부터 제조되었습니다. 그들의 보조 인자가 없으면, dodecamers는 덜 안정되고 가열시 완전히 해리되었다. oligomeric 구조는 간단한 분자 대체 접근에 의해 해결되었습니다. 방법론을 설명하기 위해 금속 이온 결합에 완전히 손상된 TmPep1050 변종의 구조는 단량체에 대한 희미한 기조의 더 이상 분해를 보여주지 않는 것으로 제시된다.
올리고머화는 많은 단백질의 생물학적 기능을 지시하는 지배적인 과정입니다. 대장균에서는단백질의 35%만이 단황1인것으로 추정됩니다. 모르피인이라고 불리는 일부 단백질은 각 올리고메릭 상태2에서뚜렷한 구조를 갖는 하위 단위를 가진 여러 올리고메릭 상태를 채택할 수도 있다. 그들의 올리고메릭 상태 사이 전환은 수시로 각 올리고머 국가가 다른 특정 활동 또는 기능을 가질 수 있기 때문에 단백질 활동을 통제하는 평균입니다. 모페에인의 몇 가지 예는 문학, 특히 포르포빌리노겐 신타제3,HPr 키나아제/포스파타제4,론 프로테아제5,락테이트 탈수소효소6,글리세랄데히드-3-인산염 탈수소효소7,피루바테 키나제8,피루바테 키나제 8, 표루바테 키나테 레카제 8, 피루바테 키나테스 8, 카테카테 키나테스10,카테카테 레테이트에이질성 에서 잘 문서화되어 있다. 최근에는 M42 아미노펩티다아제 TmPep1050을 설명했는데, 모피인과 같은 행동을 가진 효소의 또 다른 예는 그의 활동이 올리고메릭상태(11)에의존한다. 그것의 oligomeric 상태 사이 전환은 하위 단위의 몇몇 구조적인 수정을 유도하는 그것의 금속 공동 인자에 의해 중재됩니다.
M42 아미노펩티다아제 가족은 MH 클랜12,13에속하며 박테리아와고고학(14)에널리 분포되어 있다. M42 아미노펩티다스는 펩티드를 분해하는 정품 이핵 효소로, 길이15의아미노산 잔기는 최대 35개까지 이다. 12개의 서브유닛으로 만들어진 독특한 테트라헤드론 모양의 구조를 채택하고, 내부 캐비티를 지향하는 활성 부위를 가지고 있습니다. 이러한 배열은 종종 제어되지 않는 프로테오리시스를 피하기 위해 활성의 나노 구획화로 설명된다. M42 아미노펩티다스의 생리적 기능은 단백질분해(16,17)에서발생하는 프로테솜, 가수분해 펩타이드와 연관될 수 있다. 피로코커스 호리코시이는 4개의 M42 아미노펩티다아제(aminopeptidases)를 보유하고 있으며, 각각 구별되지만 보완적인특이성(18,19,20,21)을제시한다. 단수적으로, 두 가지 유형의 서브유닛으로 만든 이종복합체는 P. horikoshii에설명되어 있으며, 펩티다섬복합체(22,23)의존재를 시사한다.
M42 아미노펩티다제의 여러 구조는 문헌(11,16,18,19,20,24,25, 25,26)에기재되었다. 하위 단위는 두 개의 고유한 도메인, 촉매 도메인 및 이량화 도메인으로 구성됩니다. 촉매 도메인은 전체 MH 일족에 보존 공통 α /β 접을 채택, 고풍스러운 촉매 도메인인 아미노 펩티다아제 AP1 되는 비브리오 프로테오리틱스27. 이 분화 도메인은 PDZ와 같은 접이식16을 채택하고, 올리고머화에서의 역할 외에도, 내부캐비티(11)에서기판 접근 및 바인딩을 제어하는 역할을 가질 수 있다. 기본 빌딩 블록은 이량자이기 때문에, 도드카메르는 종종 6 개의 희미한 사람의 협회로 설명되며, 각 디머는 테트라 헤드론(16)의각 가장자리에 배치된다. M42 아미노펩티다스의 올리고머화는 금속 보조인의 가용성에 의존한다. 종종 Zn2+ 및 Co2+의희석금속 이온은 펩티드 결합 및 가수분해에 촉매적으로 관여합니다. 그들은 두 개의 별개의 바인딩 사이트에서 발견 됩니다., 즉 M1 및 M2 사이트. 두 금속 이온은 또한 PhTET2, PhTET3, PfTET3 및 TmPep105011,24,28,29에대해 입증된 바와 같이 올리고머화를 정밀하게조정한다. 금속 보조 인자가 고갈되면, 도드카메르는 PhTET2, PhTET3 및 TmPep105011,16,28,또는 단량제와 같이 디머로 분해됩니다.
여기에 TmPep1050 올리고머의 구조를 연구하는 데 사용되는 프로토콜이 여기에 제시된다. 이 프로토콜은 단백질 정제, 단백질 활성 스크리닝, 결정화, X선 회절 및 분자 대체를 포함하는 일반적인 방법의 집합입니다. 메탈로엔자임, 단백질 올리고머화, 단백질 결정화 및 분자 대체를 다루는 데 내재된 미묘함을 강조합니다. 연구의 경우 는 또한 TmPep1050 dodecamers 단량체로 더 해리 수 있는지 여부를 보여주기 위해 제시된다. 이 문제를 해결하기 위해 TmPep1050 변종 TmPep1050H60A H307A는그의-60 (M2 사이트) 및 His-307 (M1 사이트)을 Ala 잔류물으로 돌연변이하여 금속 결합 부위가 손상된 금속 결합 부위를 연구했습니다. 이 프로토콜은 다른 M42 아미노펩티다제 또는 모르피인과 같은 행동을 가진 금속로효소를 연구하기 위해 수용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 프로토콜은 구조 수준에서 TmPep1050의 디머-도데카메르 전환을 이해할 수 있게 한다. 방법론은 TmPep1050 올리고머11의구조를 결정하기 위해 이전에 경험되었다. 가장 어려운 단계는 안정적인 디머로 도데카운더의 해리를 촉진하는 조건을 찾는 것이었습니다. 이러한 조건은 금속 이온 공동 인자가 추가 될 때 디머가 dodecamers로 재결합 할 수있을만큼 온화했다. 올?…
The authors have nothing to disclose.
우리는이 논문을 교정하고 건설적인 의견을 주는 마틴 로버에게 감사드립니다. Proxima 2 빔라인(SOLEIL 싱크로트론)에 대한 액세스는 블록 할당 그룹 20151139 내에 있었습니다.
1,10-phenanthroline | Sigma-Aldrich | 13, 137-7 | |
Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K | Merck Millipore | UFC503096 | |
Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K | Merck Millipore | UFC903024 | |
Benzonase Nuclease | Merck Millipore | 70664-3 | |
CCP4 | N/A | visit http://www.ccp4.ac.uk/ | |
cOmplete EDTA-free | Roche | 5056489001 | |
Coot | N/A | visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | |
Crystal Screen I | Hampton Research | HR2-110 | |
Crystal Screen II | Hampton Research | HR2-112 | |
DreamTaq Green PCR Master Mix | ThermoFisher Scientific | K1082 | |
EasyXtal 15-well tool | NeXtal | 132007 | |
Escherichia coli PPY strain | N/A | see reference 31 | |
Escherichia coli XL1 blue strain | Agilent | 200249 | |
Gel Filtration Calibration Kit HMW | GE Healthcare Life Sciences | 28-4038-42 | |
Gel Filtration Calibration Kit LMW | GE Healthcare Life Sciences | 28-4038-41 | |
Gel Filtration Standard | Biorad | 1511901 | |
GeneJET Plasmid Miniprep Kit | ThermoFisher Scientific | K0503 | |
Index | Hampton Research | HR2-144 | |
Litholoops | Molecular Dimensions | ||
L-leucine-p-nitroanilide | Bachem AG | 40010720025 | |
Natrix 1 | Hampton Research | HR2-116 | |
Natrix 2 | Hampton Research | HR2-117 | |
Neggia plugin | Dectris | N/A | visit https://www.dectris.com/ |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite I | NeXtal | 130724 | |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite II | NeXtal | 130725 | |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite III | NeXtal | 130726 | |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV | NeXtal | 130727 | |
pBAD-TOPO | ThermoFisher Scientific | K430001 | |
Phenix | N/A | visit https://www.phenix-online.org/ | |
Phusion High-Fidelity DNA polymerase | ThermoFisher Scientific | F-530L | |
Salt RX 1 | Hampton Research | HR2-107 | |
Salt RX 2 | Hampton Research | HR2-109 | |
SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO | ThermoFisher Scientific | 88242 | |
Source 15Phe | GE Healthcare Life Sciences | 17014702 | |
Source 15Q | GE Healthcare Life Sciences | 17094705 | |
Superdex 200 prep grade | GE Healthcare Life Sciences | 17104301 | |
Thermotoga maritima MSB8 strain | American Type Culture Collection | ATCC 43589 | |
TmCD00089984 | DNASU Plasmid Repository | N/A | |
XDS | N/A | visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/ | |
xdsme | N/A | visit https://github.com/legrandp/xdsme |