Dit protocol is ontwikkeld om de dimer-dodecamer overgang van TmPep1050, een M42 aminopeptidase, op structureel niveau te bestuderen. Het is een eenvoudige pijplijn vanaf eiwitzuivering tot röntgengegevensverwerking. Crystallogenesis, data set indexatie, en moleculaire vervanging zijn benadrukt door middel van een geval van studie, TmPep1050H60A H307A variant.
De M42 aminopeptidases vormen functioneel actieve complexen gemaakt van 12 subeenheden. Hun assemblageproces lijkt te worden gereguleerd door hun metalen ionen cofactoren triggering een dimer-dodecamer overgang. Bij metaalionbinding vinden verschillende structurele wijzigingen plaats in de actieve site en op de interactie-interface, waardoor dimers worden gevormd om de zelfassemblage te bevorderen. Om dergelijke wijzigingen waar te nemen, moeten stabiele oligomeren vóór de structurele studie worden geïsoleerd. Hier gemeld is een methode die het mogelijk maakt de zuivering van stabiele dodecamers en dimers van TmPep1050, een M42 aminopeptidase van T. maritima, en hun structuur bepaling door X-ray kristallografie. Dimers werden bereid van dodecamers door het verwijderen van metalen ionen met een chelaatvormer. Zonder hun cofactor werden dodecamers minder stabiel en werden ze volledig gescheiden bij verwarming. De oligomeric structuren werden opgelost door de ongecompliceerde moleculaire vervangingsbenadering. Ter illustratie van de methodologie wordt de structuur van een TmPep1050-variant, volledig aangetast in metaalionbinding, gepresenteerd waaruit blijkt dat er geen verdere uitsplitsing van dimers op monomeren wordt weergegeven.
Oligomerisatie is een overheersend proces dat de biologische functies van veel eiwitten dicteert. In Escherichia coliwordt geschat dat slechts 35% van de eiwitten monomeerbaar is1. Sommige eiwitten, genaamd morpheeins, kunnen zelfs verschillende oligomerische toestanden aannemen met subeenheden met een duidelijke structuur in elke oligomerische toestand2. De overgang tussen hun oligomerische toestanden is vaak een gemiddelde om eiwitactiviteit te reguleren, omdat elke oligomerische toestand een andere specifieke activiteit of functie kan hebben. Verschillende voorbeelden van morpheeins zijn goed gedocumenteerd in de literatuur, met name de porphobilinogen synthase3, HPr kinase/phosphatase4, Lon protease5, lactate dehydrogenase6, glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase7, pyruvate kinase8, citraat synthase9, en ribonuclease A10. Onlangs hebben we beschreven de M42 aminopeptidase TmPep1050, een ander voorbeeld van enzym met morphein-achtig gedrag, waarvan de activiteit afhankelijk is van zijn oligomerieke toestanden11. De overgang tussen de oligomerische toestanden wordt bemiddeld door zijn metaalcofactoren die verschillende structurele wijzigingen van de subeenheden veroorzaken.
De M42 aminopeptidase familie behoort tot de MH clan12,13, en wordt op grote schaal verspreid onder Bacteriën en Archaea14. De M42 aminopeptidases zijn echte dinucleaire enzymen die peptiden tot 35 aminozuurresten in lengte15degraderen. Ze nemen een eigenaardige tetraëdervormige structuur aan die bestaat uit 12 subeenheden met hun actieve locaties gericht op een innerlijke holte. Een dergelijke regeling wordt vaak beschreven als een nano-compartimentering van de activiteit om ongecontroleerde proteolyse te voorkomen. De fysiologische functie van de M42 aminopeptidases kan worden geassocieerd met het proteasoom, hydrolyserende peptiden als gevolg van eiwitafbraak16,17. Pyrococcus horikoshii bezit vier M42 aminopeptidases, die elk verschillende maar complementaire specificiteiten18,19,20,21presenteren . Bijzonder, heterocomplexen gemaakt van twee verschillende soorten subeenheden zijn beschreven in P. horikoshii, wat wijst op het bestaan van peptidasome complexen22,23.
Verschillende structuren van M42 aminopeptidases zijn beschreven in de literatuur11,16,18,19,20,24,25,26. De subunit bestaat uit twee verschillende domeinen, een katalytisch domein en een dimerisatiedomein. De katalytische domein neemt een gemeenschappelijke α / β vouw bewaard in de hele MH-clan, de archetypische katalytische domein wordt de aminopeptidase Ap1 van Vibrio proteolyticus27. De dimerization domein neemt een PDZ-achtige vouw16 en kan, naast zijn rol in de oligomerisatie, een rol hebben bij het regelen van substraattoegang en binding in de binnenholte11. Aangezien de basisbouwsteen een dimer is, wordt de dodecamer vaak omschreven als de associatie van zes dimers, waarbij elke dimer aan elke rand van de tetraëder16wordt geplaatst. De oligomerisatie van de M42 aminopeptidases is afhankelijk van de beschikbaarheid van zijn metaalcofactoren. Divalent metaalionen, vaak Zn2+ en Co2+, zijn katalytisch betrokken bij de peptide binding en hydrolyse. Ze zijn te vinden in twee verschillende bindende sites, namelijk M1 en M2 sites. De twee metalen ionen rijden ook en stemmen de oligomerisatie zoals aangetoond voor PhTET2, PhTET3, PfTET3 en TmPep105011,24,28,29. Wanneer de metaalcofactoren uitgeput zijn, demonteert de dodecamer in dimers, zoals in PhTET2, PhTET3 en TmPep105011,16,28of zelfs monomeren, zoals in PhTET2 en PfTET324,29.
Hier gepresenteerd is een protocol dat wordt gebruikt voor het bestuderen van de structuren van TmPep1050 oligomers. Dit protocol is een reeks gemeenschappelijke methoden, waaronder eiwitzuivering, proteolytische activiteitscreening, kristallisatie, röntgendiffractie en moleculaire vervanging. Subtiliteiten die inherent zijn aan het omgaan met metalloenzymen, eiwit oligomerisatie, eiwit kristallisatie en moleculaire vervanging worden benadrukt. Er wordt ook een studiegeval gepresenteerd om aan te tonen of TmPep1050 dodecamers zich verder kunnen distantiëren in monomeren of niet. Om deze vraag te beantwoorden, een TmPep1050 variant, TmPep1050H60A H307A, is onderzocht waarvan de metalen binding sites worden aangetast door het muteren van His-60 (M2 site) en His-307 (M1 site) naar Ala residuen. Dit protocol kan worden ondergebracht om andere M42 aminopeptidases of metaalloenzymen met morpheein-achtig gedrag te bestuderen.
Het protocol hierin beschreven maakt het mogelijk inzicht in de dimer-dodecamer overgang van TmPep1050 op structureel niveau. De methodologie werd eerder ervaren voor het bepalen van de structuur van beide TmPep1050 oligomers11. De meest uitdagende stap was het vinden van voorwaarden ter bevordering van de dissociatie van dodecamers in stabiele dimers. Dergelijke omstandigheden moesten mild genoeg zijn om de koppeling van dimers in dodecamers mogelijk te maken toen de metaal-ionencofactor werd toe…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Martine Roovers voor het nalezen van deze krant en het geven van constructieve opmerkingen. Toegang tot Proxima 2 beamline (SOLEIL synchrotron) viel binnen Block Allocation Groups 20151139.
1,10-phenanthroline | Sigma-Aldrich | 13, 137-7 | |
Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K | Merck Millipore | UFC503096 | |
Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K | Merck Millipore | UFC903024 | |
Benzonase Nuclease | Merck Millipore | 70664-3 | |
CCP4 | N/A | visit http://www.ccp4.ac.uk/ | |
cOmplete EDTA-free | Roche | 5056489001 | |
Coot | N/A | visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | |
Crystal Screen I | Hampton Research | HR2-110 | |
Crystal Screen II | Hampton Research | HR2-112 | |
DreamTaq Green PCR Master Mix | ThermoFisher Scientific | K1082 | |
EasyXtal 15-well tool | NeXtal | 132007 | |
Escherichia coli PPY strain | N/A | see reference 31 | |
Escherichia coli XL1 blue strain | Agilent | 200249 | |
Gel Filtration Calibration Kit HMW | GE Healthcare Life Sciences | 28-4038-42 | |
Gel Filtration Calibration Kit LMW | GE Healthcare Life Sciences | 28-4038-41 | |
Gel Filtration Standard | Biorad | 1511901 | |
GeneJET Plasmid Miniprep Kit | ThermoFisher Scientific | K0503 | |
Index | Hampton Research | HR2-144 | |
Litholoops | Molecular Dimensions | ||
L-leucine-p-nitroanilide | Bachem AG | 40010720025 | |
Natrix 1 | Hampton Research | HR2-116 | |
Natrix 2 | Hampton Research | HR2-117 | |
Neggia plugin | Dectris | N/A | visit https://www.dectris.com/ |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite I | NeXtal | 130724 | |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite II | NeXtal | 130725 | |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite III | NeXtal | 130726 | |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV | NeXtal | 130727 | |
pBAD-TOPO | ThermoFisher Scientific | K430001 | |
Phenix | N/A | visit https://www.phenix-online.org/ | |
Phusion High-Fidelity DNA polymerase | ThermoFisher Scientific | F-530L | |
Salt RX 1 | Hampton Research | HR2-107 | |
Salt RX 2 | Hampton Research | HR2-109 | |
SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO | ThermoFisher Scientific | 88242 | |
Source 15Phe | GE Healthcare Life Sciences | 17014702 | |
Source 15Q | GE Healthcare Life Sciences | 17094705 | |
Superdex 200 prep grade | GE Healthcare Life Sciences | 17104301 | |
Thermotoga maritima MSB8 strain | American Type Culture Collection | ATCC 43589 | |
TmCD00089984 | DNASU Plasmid Repository | N/A | |
XDS | N/A | visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/ | |
xdsme | N/A | visit https://github.com/legrandp/xdsme |