Summary

Imaging in tempo reale della migrazione indotta da CCL5 di cellule staminali scheletriche periosteali nei topi

Published: September 16, 2020
doi:

Summary

Questo protocollo descrive il rilevamento della migrazione delle cellule staminali scheletriche periosteali mediate da CCL5 in tempo reale utilizzando la microscopia intravitale animale vivo.

Abstract

Le cellule staminali scheletriche periosteali (P-SSC) sono essenziali per il mantenimento e la riparazione ossea per tutta la vita, rendendole un punto focale ideale per lo sviluppo di terapie per migliorare la guarigione delle fratture.  Le cellule periosteali migrano rapidamente verso una lesione per fornire nuovi condrociti e osteoblasti per la guarigione delle fratture. Tradizionalmente, l’efficacia di una citochina per indurre la migrazione cellulare è stata condotta solo in vitro eseguendo un test transwell o scratch. Con i progressi nella microscopia intravitale utilizzando l’eccitazione multifotonica, è stato recentemente scoperto che 1) le P-SSC esprimono il gene migratore CCR5 e 2) il trattamento con il ligando CCR5 noto come CCL5 migliora la guarigione delle fratture e la migrazione delle P-SSC in risposta a CCL5. Questi risultati sono stati acquisiti in tempo reale. Qui è descritto un protocollo per visualizzare la migrazione P-SSC dalla nicchia delle cellule staminali scheletriche di sutura calvariale (SSC) verso una lesione dopo il trattamento con CCL5. Il protocollo descrive in dettaglio la costruzione di un sistema di ritenuta per topo e di un supporto per l’imaging, la preparazione chirurgica della calvaria del topo, l’induzione di un difetto di calvaria e l’acquisizione dell’imaging time-lapse.

Introduction

La riparazione delle fratture è un processo dinamico e multicellulare che si distingue dallo sviluppo scheletrico embrionale e dal rimodellamento. Durante questo processo, l’induzione di segnali di lesione dal tessuto danneggiato è seguita dal rapido reclutamento, proliferazione e successiva differenziazione delle cellule staminali /progenitrici scheletriche, che sono tutte fondamentali per la stabilità generale e la fissazione delle fratture1. In particolare, le prime fasi della guarigione delle fratture richiedono la formazione di callo molle, che è principalmente attribuita alle cellule residenti periosteali2. Quando le ossa sono ferite, un sottogruppo di cellule periosteali risponde rapidamente e contribuisce a nuovi intermedi cartilagineici differenziati e osteoblasti all’interno del callo3, implicando la presenza di una distinta popolazione di cellule staminali / progenitrici scheletriche all’interno del periostio. Pertanto, l’identificazione e la caratterizzazione funzionale delle cellule staminali scheletriche residenti nel periostio (SSC) costituiscono un approccio terapeutico promettente per le malattie degenerative dell’osso e i difetti ossei4.

Si ritiene che le SSC risiedano in più posizioni tissutali, incluso il midollo osseo. Analogamente al midollo osseo, anche nel perostio sono state identificate SSC osteogeniche/condrogene4,5,6.  Queste SSC periosteali (P-SSC) possono essere etichettate con marcatori di lignaggio mesenchimale precoce (ad esempio, Prx1-Cre5, Ctsk-Cre7 e Axin2-CreER8) durante lo sviluppo osseo fetale4,7,8,9,10. Una limitazione significativa di questi singoli modelli di tracciamento del lignaggio genetico è che esiste una sostanziale eterogeneità all’interno delle popolazioni cellulari marcate. Inoltre, non sono in grado di distinguere le SSC etichettate dalla loro progenie in vivo. Per ovviare a questa limitazione, abbiamo recentemente sviluppato un mouse a doppio reporter (Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+) per visualizzare distintamente i P-SSC dalle SSC del midollo osseo (BM-SSC)11. Con questo modello, è stato determinato che le P-SSC sono contrassegnate dalla doppia marcatura Mx1+αSMA+, mentre le cellule Mx1+ più differenziate risiedono nel midollo osseo, nelle superfici endosteale e periostale e nelle ossa corticali e trabecolari11,12.

Citochine multiple e fattori di crescita sono noti per regolare il rimodellamento e la riparazione ossea e sono stati testati per il miglioramento della riparazione scheletrica nei difetti critici del segmento1,13. Tuttavia, a causa della complessità cellulare dei modelli di lesione generati attraverso l’interruzione della barriera fisica del compartimento osseo, gli effetti diretti di queste molecole sulla migrazione e l’attivazione endogena di P-SSC durante la guarigione non sono chiari. Le caratteristiche funzionali e le dinamiche migratorie delle SSC sono spesso valutate in vitro eseguendo un test transwell o scratch, in combinazione con citochine o fattori di crescita noti per indurre la migrazione in altre popolazioni cellulari. Pertanto, l’interpretazione dei risultati di questi esperimenti in vitro per l’applicazione nei loro corrispondenti sistemi in vivo è impegnativa. Attualmente, la valutazione in vivo della migrazione delle cellule staminali/progenitrici scheletriche non è tipicamente osservata in tempo reale; piuttosto, viene misurato in punti temporali fissi post-frattura5,7,14,15,16.

Un limite di questo metodo è che la migrazione non viene valutata a livello di singola cella; piuttosto, viene misurato attraverso i cambiamenti nelle popolazioni cellulari. A causa dei recenti progressi nella microscopia intravitale animale vivo e della generazione di topi reporter aggiuntivi, è ora possibile il monitoraggio in vivo delle singole cellule. Utilizzando la microscopia intravitale di animali vivi, abbiamo osservato la distinta migrazione delle P-SSC dalla nicchia di sutura calvariale a una lesione ossea entro 24-48 ore dopo la lesione nei topi Mx1 / Tomato / αSMA-GFP.

CCL5/CCR5 è stato recentemente identificato come un meccanismo di regolamentazione che influenza il reclutamento e l’attivazione delle P-SSC durante la risposta precoce all’infortunio. È interessante notare che non è stato rilevato alcuna migrazione P-SSC sostanziale in risposta a un infortunio in tempo reale. Tuttavia, il trattamento di una lesione con CCL5 produce una migrazione robusta e distinta direzionalmente delle P-SSC, che può essere catturata in tempo reale. Pertanto, l’obiettivo di questo protocollo è quello di fornire una metodologia dettagliata per registrare la migrazione in vivo di P-SSC in tempo reale dopo il trattamento con CCL5.

Protocol

Tutti i topi sono stati mantenuti in condizioni prive di agenti patogeni e tutte le procedure sono state approvate dal Baylor College of Medicine’s Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). 1. Preparazione del mouse Incrociare i mouse Mx1-Cre17 e Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Tom)18 (acquistati dal Jackson Laboratory) con mouse αSMA-GFP (forniti qui dai dottori Ivo Kalajzic e Henry Kro…

Representative Results

È stato proposto che i progenitori scheletrici abbiano un potenziale migratorio o circolatorio20. Recentemente, sono stati generati mouse reporter Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP), in cui i P-SSC sono contrassegnati dalla doppia etichettatura Mx1+α SMA+ (Figura 2A,B). La migrazione sostanziale di Mx1<…

Discussion

Durante la guarigione ossea, le cellule periosteali sono la principale fonte di condrociti e osteoblasti recentemente differenziati all’interno di un callo di lesione3. Analogamente al midollo osseo, anche nel perostio sono state identificate SSC osteogeniche/condrogene4,5,6. Valutare le caratteristiche funzionali endogene di P-SSC è tecnicamente impegnativo. Spesso, le dinamiche migratorie delle SSC son…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato dal Bone Disease Program of Texas Award, dal Caroline Wiess Law Fund Award e dal NIAMS del National Institutes of Health con i numeri di premio R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946 a D.P.  Ringraziamo M.E. Dickinson e T.J. Vadakkan nel BCM Optical Imaging and Vital Microscopy Core e nel BCM Advanced Technology Cores con finanziamenti da NIH (AI036211, CA125123 e DK056338).

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Materials

½” optical post ThorLabs TR2 For imaging mount
1 mL syringe BD 309659
27G needle BD PercisionGlide 305111
29G insulin syringe McKesson 102-SN05C905P
50 mL conicol tube Falcon 352098 For mouse restraint
Adjustable angle plate Renishaw R-PCA-5023-50-20 For imaging mount
Alcohol wipes Coviden 6818
betadine surgical scrub Henry Schen 67618-151-16
Buprenorphine SR-LAB ZooPharm 1mg/mL Sustained Release
Combo III Obtained from staff veterinarian N/A 37.6 mg/mL Ketamine; 1.9 mg/mL Xylazine; 0.37 mg/mL Acepronazine
Coverslip Fisher 12-545-87 24 x 40 premium superslip
Fine tip forcepts FST 11254-20
Ketamine KetaVed 50989-161-06 100 mg/mL
Leica TCS SP8MP with DM6000CFS Leica Microsystems N/A
Matrigel R & D Systems 344500101
Medical tape McKesson 100199 3" x 10 yds (7.6 cm x 9.1 m)
Methocellulose Electron Microscopy Sciences 19560
Microdissection scissors FST 1456-12
Motorized stage Anaheim automation N/A
Needle holder FST 12500-12
Nonabsorbable sutures McKesson S913BX monofilament nylon 5-0 nonabsorbable sutures with attached C-1 reverse cutting needle
Opthalmic ointment Rugby 0536-1086-91
RANTES Biolegend 594202 10 µg/50 µL
Right-angle clamp for ½” post, 3/16” Hex ThorLabs RA90 For imaging mount
Spring-loaded 3/16” Hex-locking ¼” thumbscrew ThorLabs TS25H For imaging mount
Sterile cotton swabs Henry Schen 100-9249
Sterile DPBS (1x) Corning 21-030-CV
Sterile drapes McKessen 25-517
Surgical gloves McKessen 3158VA
Triple antibiotic ointment Taro Pharmaceuticals U.s.a., Inc. 51672-2120-2
Vacutainer blood collection set BD REF 367298 25G butterfly needle infusion set with 12" tubing

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Cite This Article
Ortinau, L., Lei, K., Jeong, Y., Park, D. Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice. J. Vis. Exp. (163), e61162, doi:10.3791/61162 (2020).

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