Summary

Imagerie en temps réel de la migration induite par CCL5 de cellules souches squelettiques périostées chez la souris

Published: September 16, 2020
doi:

Summary

Ce protocole décrit la détection de la migration des cellules souches squelettiques périostées médiées par CCL5 en temps réel à l’aide de la microscopie intravitale d’animaux vivants.

Abstract

Les cellules souches squelettiques périostées (P-SSC) sont essentielles à l’entretien et à la réparation des os tout au long de leur vie, ce qui en fait un point de mire idéal pour le développement de thérapies visant à améliorer la guérison des fractures.  Les cellules périostées migrent rapidement vers une blessure pour fournir de nouveaux chondrocytes et ostéoblastes pour la guérison des fractures. Traditionnellement, l’efficacité d’une cytokine pour induire la migration cellulaire n’a été réalisée in vitro qu’en effectuant un test transwell ou scratch. Avec les progrès de la microscopie intravitale utilisant l’excitation multiphotonique, il a été récemment découvert que 1) les P-SSC expriment le gène migrateur CCR5 et 2) le traitement avec le ligand CCR5 connu sous le nom de CCL5 améliore la cicatrisation des fractures et la migration des P-SSC en réponse à CCL5. Ces résultats ont été saisis en temps réel. Décrit ici est un protocole pour visualiser la migration de la P-SSC de la niche des cellules souches squelettiques (SSC) de suture calvariaire vers une blessure après un traitement par CCL5. Le protocole détaille la construction d’une fixation de souris et d’un support d’imagerie, la préparation chirurgicale de la calvaire de la souris, l’induction d’un défaut de calvaire et l’acquisition de l’imagerie en accéléré.

Introduction

La réparation des fractures est un processus dynamique et multicellulaire qui se distingue du développement et du remodelage du squelette embryonnaire. Au cours de ce processus, l’induction de signaux de blessure provenant de tissus endommagés est suivie du recrutement, de la prolifération et de la différenciation subséquente des cellules souches/progénitrices squelettiques, qui sont toutes essentielles à la stabilité globale et à la fixation des fractures1. En particulier, les premiers stades de la guérison des fractures nécessitent la formation de callosités molles, qui est principalement attribuée aux cellules résidentes périostées2. Lorsque les os sont blessés, un sous-ensemble de cellules périostées réagit rapidement et contribue à de nouveaux intermédiaires cartilagineux et ostéoblastes dans le callosité3, impliquant la présence d’une population distincte de cellules souches squelettiques / progénitrices dans le périoste. Par conséquent, l’identification et la caractérisation fonctionnelle des cellules souches squelettiques (CSE) résidentes du périoste constituent une approche thérapeutique prometteuse pour les maladies osseuses dégénératives et les défauts osseux4.

On pense que les SSC résident dans plusieurs emplacements tissulaires, y compris la moelle osseuse. À l’instar de la moelle osseuse, des SSC ostéogéniques/chondrogènes ont également été identifiés dans le périoste4,5,6.  Ces SSC périostés (P-SSC) peuvent être marqués avec des marqueurs de lignée mésenchymateuse précoce (c.-à-d. Prx1-Cre5, Ctsk-Cre7 et Axin2-CreER8) au cours du développement osseux du fœtus4,7,8,9,10. Une limitation importante de ces modèles de traçage de lignée génétique unique est qu’il existe une hétérogénéité substantielle au sein des populations cellulaires marquées. De plus, ils ne peuvent pas distinguer les SSC étiquetés de leur progéniture in vivo. Pour remédier à cette limitation, nous avons récemment développé une souris rapporteur double (Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+) pour visualiser distinctement les P-SSC des SSC de moelle osseuse (BM-SSCs)11. Avec ce modèle, il a été déterminé que les P-SSC sont marqués par un double marquage Mx1+αSMA+, tandis que les cellules Mx1+ plus différenciées résident dans la moelle osseuse, les surfaces endostéale et périostéale, ainsi que dans les os corticaux et trabéculaires11,12.

De multiples cytokines et facteurs de croissance sont connus pour réguler le remodelage et la réparation des os et ont été testés pour l’amélioration de la réparation squelettique dans les défauts critiques du segment1,13. Cependant, en raison de la complexité cellulaire des modèles de blessures générés par la perturbation de la barrière physique du compartiment osseux, les effets directs de ces molécules sur la migration et l’activation endogènes de P-SSC pendant la guérison ne sont pas clairs. Les caractéristiques fonctionnelles et la dynamique migratoire des SSC sont souvent évaluées in vitro en effectuant un test de transpuit ou de grattage, en combinaison avec des cytokines ou des facteurs de croissance connus pour induire la migration dans d’autres populations cellulaires. Ainsi, l’interprétation des résultats de ces expériences in vitro pour une application dans leurs systèmes in vivo correspondants est difficile. À l’heure actuelle, l’évaluation in vivo de la migration des cellules souches/progénitrices squelettiques n’est généralement pas observée en temps réel; il est plutôt mesuré à des points temporels fixes après la fracture5,7,14,15,16.

Une limite de cette méthode est que la migration n’est pas évaluée au niveau d’une seule cellule; il est plutôt mesuré par des changements dans les populations cellulaires. Grâce aux progrès récents de la microscopie intravitale d’animaux vivants et à la génération de souris rapporteures supplémentaires, le suivi in vivo de cellules individuelles est désormais possible. En utilisant la microscopie intravitale d’animaux vivants, nous avons observé la migration distincte des P-SSC de la niche de suture calvariaire vers une lésion osseuse dans les 24 à 48 heures suivant la blessure chez les souris Mx1 / Tomato / αSMA-GFP.

CCL5/CCR5 a récemment été identifié comme un mécanisme de réglementation influençant le recrutement et l’activation des P-SSC au cours de l’intervention précoce en cas de blessure. Fait intéressant, il n’y a pas eu de détection en temps réel d’une migration importante de P-SSC en réponse à une blessure. Cependant, le traitement d’une blessure avec CCL5 produit une migration robuste et directionnelle distincte des P-SSC, qui peut être capturée en temps réel. Par conséquent, l’objectif de ce protocole est de fournir une méthodologie détaillée pour enregistrer la migration in vivo des P-SSC en temps réel après le traitement par CCL5.

Protocol

Toutes les souris ont été maintenues dans des conditions exemptes d’agents pathogènes et toutes les procédures ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) du Baylor College of Medicine. 1. Préparation de la souris Croisez des souris Mx1-Cre17 et Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Tom)18 (achetées au jackson Laboratory) avec des souris αSMA-GFP (fo…

Representative Results

Il a été proposé que les progéniteurs squelettiques aient un potentiel migratoire ou circulatoire20. Récemment, des souris rapporteures Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) ont été générées, dans lesquelles les P-SSC sont marquées par un double marquage Mx1+α SMA+ (Figure 2A,B). Une migration importante …

Discussion

Au cours de la cicatrisation osseuse, les cellules périostées sont la principale source de chondrocytes et d’ostéoblastes nouvellement différenciés dans un callosité de blessure3. À l’instar de la moelle osseuse, des SSC ostéogéniques/chondrogènes ont également été identifiés dans le périoste4,5,6. L’évaluation des caractéristiques fonctionnelles endogènes du P-SSC est techniquemen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le Bone Disease Program of Texas Award, le Caroline Wiess Law Fund Award et le NIAMS des National Institutes of Health sous les numéros de prix R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946 à D.P.  Nous remercions M.E. Dickinson et T.J. Vadakkan dans le BCM Optical Imaging and Vital Microscopy Core et le BCM Advanced Technology Cores avec le financement des NIH (AI036211, CA125123 et DK056338).

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Materials

½” optical post ThorLabs TR2 For imaging mount
1 mL syringe BD 309659
27G needle BD PercisionGlide 305111
29G insulin syringe McKesson 102-SN05C905P
50 mL conicol tube Falcon 352098 For mouse restraint
Adjustable angle plate Renishaw R-PCA-5023-50-20 For imaging mount
Alcohol wipes Coviden 6818
betadine surgical scrub Henry Schen 67618-151-16
Buprenorphine SR-LAB ZooPharm 1mg/mL Sustained Release
Combo III Obtained from staff veterinarian N/A 37.6 mg/mL Ketamine; 1.9 mg/mL Xylazine; 0.37 mg/mL Acepronazine
Coverslip Fisher 12-545-87 24 x 40 premium superslip
Fine tip forcepts FST 11254-20
Ketamine KetaVed 50989-161-06 100 mg/mL
Leica TCS SP8MP with DM6000CFS Leica Microsystems N/A
Matrigel R & D Systems 344500101
Medical tape McKesson 100199 3" x 10 yds (7.6 cm x 9.1 m)
Methocellulose Electron Microscopy Sciences 19560
Microdissection scissors FST 1456-12
Motorized stage Anaheim automation N/A
Needle holder FST 12500-12
Nonabsorbable sutures McKesson S913BX monofilament nylon 5-0 nonabsorbable sutures with attached C-1 reverse cutting needle
Opthalmic ointment Rugby 0536-1086-91
RANTES Biolegend 594202 10 µg/50 µL
Right-angle clamp for ½” post, 3/16” Hex ThorLabs RA90 For imaging mount
Spring-loaded 3/16” Hex-locking ¼” thumbscrew ThorLabs TS25H For imaging mount
Sterile cotton swabs Henry Schen 100-9249
Sterile DPBS (1x) Corning 21-030-CV
Sterile drapes McKessen 25-517
Surgical gloves McKessen 3158VA
Triple antibiotic ointment Taro Pharmaceuticals U.s.a., Inc. 51672-2120-2
Vacutainer blood collection set BD REF 367298 25G butterfly needle infusion set with 12" tubing

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Cite This Article
Ortinau, L., Lei, K., Jeong, Y., Park, D. Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice. J. Vis. Exp. (163), e61162, doi:10.3791/61162 (2020).

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