Un sistema gnotobiótico para el estudio del ensamblaje del microbioma en la filosfera y en la fermentación vegetal
Summary
Se ha desarrollado un método para cultivar coles Napa libres de gérmenes que permite a los investigadores evaluar cómo interactúan las especies microbianas individuales o las comunidades microbianas multiespecie en las superficies de las hojas de repollo. También se presenta un extracto vegetal estéril que se puede utilizar para medir los cambios en la composición de la comunidad durante la fermentación vegetal.
Abstract
La filosfera, la parte sobre el suelo de la planta que puede ser colonizada por microbios, es un sistema modelo útil para identificar procesos de ensamblaje comunitario microbiano. Este protocolo describe un sistema para estudiar la dinámica de la comunidad microbiana en la filosfera de las plantas de repollo de Napa. Describe cómo cultivar plantas libres de gérmenes en tubos de ensayo con un sustrato de arcilla calcinada y caldo de nutrientes. La inoculación de plantas libres de gérmenes con cultivos microbianos específicos ofrece oportunidades para medir el crecimiento microbiano y la dinámica comunitaria en la filosfera. A través del uso de extracto vegetal estéril producido a partir de coles cambios en las comunidades microbianas que se producen durante la fermentación también se puede evaluar. Este sistema es relativamente simple y barato de configurar en el laboratorio y se puede utilizar para abordar cuestiones ecológicas clave en el ensamblaje de la comunidad microbiana. También ofrece oportunidades para entender cómo la composición de la comunidad filosfera puede afectar la diversidad microbiana y la calidad de las fermentaciones vegetales. Este enfoque para el desarrollo de comunidades filosfera de repollo gnotobiótico podría aplicarse a otras especies de plantas silvestres y agrícolas.
Introduction
La diversidad microbiana de la filosfera juega un papel importante en el mantenimiento de la salud de la planta y también puede influir en la capacidad de las plantas para soportar el estrés ambiental1,2,3,4,5. A su vez, la salud de los cultivos afecta directamente a la inocuidad y calidad de los alimentos6,,7. Las plantas desempeñan un papel en el funcionamiento del ecosistema y sus microbiomas asociados afectan a la capacidad de las plantas para llevar a cabo estas actividades, así como influyen directamente en el entorno en sí8. Mientras que los científicos han comenzado a descifrar la función y composición de la filosfera, los procesos ecológicos que influyen en la asamblea comunitaria microbiana filosfera no se entienden completamente9,,10. El microbioma filosfera es un excelente sistema experimental para estudiar la ecología de los microbiomas11. Estas comunidades son relativamente simples y muchos de los miembros de la comunidad se pueden cultivar en los medios de laboratorio estándar10,,12,,13.
Las hortalizas fermentadas son un sistema en el que la estructura comunitaria de la filosfera tiene importantes consecuencias. Tanto en el chucrut como en el kimchi, los microbios que se producen naturalmente en las hojas vegetales (la filosfera de las especies de Brassica) sirve como el inóculo para la fermentación14,15. Las bacterias del ácido láctico (LAB) se consideran miembros ubicuos de los microbiomas vegetales, sin embargo pueden estar en baja abundancia en la filosfera16. Una fuerte selección abiótica durante la fermentación impulsa un cambio en la composición de la comunidad microbiana que permite que las bacterias del ácido láctico aumenten en abundancia. A medida que LAB crece, producen ácido láctico que crea el ambiente ácido de los productos vegetales fermentados17. El vínculo entre la filosfera y el fermento proporciona la oportunidad de utilizar las verduras como modelo para entender cómo se estructuran los microbiomas.
Hemos desarrollado métodos para cultivar coles Napa libres de gérmenes y para inocularlas con comunidades microbianas específicas utilizando botellas de aerosol. Este es un método barato y confiable de inocular uniformemente el repollo con microbios individuales o comunidades mixtas. También se ha desarrollado un extracto vegetal estéril (SVE) a partir de tres tipos/variedades diferentes de col: repollo rojo y verde (Brassica oleracea) y repollo Napa (B. rapa). La adición de sal a estas SVEs replica el entorno de fermentación y permite estudios experimentales a pequeña escala y relativamente de alto rendimiento del ensamblaje del microbioma de fermentación. Estos métodos se pueden utilizar para estudiar el ensamblaje de la comunidad microbiana en la filosfera y cómo la dinámica de la comunidad microbiana en la filosfera puede estar relacionada con el éxito de la fermentación vegetal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las plantas de repollo Napa libres de gérmenes se han utilizado para estudiar la limitación de dispersión de las bacterias del ácido láctico en la filosfera de repollo Napa17. Las coles Napa libres de gérmenes también se pueden utilizar para probar el crecimiento individual o par en la filosfera (Figura 1). Los métodos para la elaboración de extracto vegetal estéril han sido probados para tres variedades diferentes de repollo: rojo, verde y Napa. Cada una de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la subvención USDA-NIFA: 2017-67013-26520. Tracy Debenport y Claire Fogan proporcionaron soporte técnico y Ruby Ye y Casey Cosetta proporcionan comentarios útiles sobre las primeras versiones de este manuscrito.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 20170-650 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 7-way tray tray | Sigma Magenta | T8654 | |
| Amber Round Boston Glass Bottle | GPS 712OZSPPK12BR | Ordered on Amazon.com from various suppliers | |
| Basket coffee filters | If you care | (unbleached paper) Purchased from Wholefoods | |
| Bleach (mercury-free) | Austin's | 50-010-45 | |
| Borosilicate Glass tubes | VWR | 47729-586 | |
| Calcined clay | Turface | MVP | Ordered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm |
| Cuisinart blender | Cuisinart | Cuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup | |
| Dissection scissors | 7-389-A | American Educational Products | Ordered on Amazon.com |
| Ethanol | VWR | 89125-172 | |
| Forceps | Aven | 18434 | Ordered on Amazon.com |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| KleenGuard M10 | Kimberley-Clark | 64240 | |
| Large plastic container | Rubbermaid | Ordered on Amazon.com | |
| Light racks | Gardner's Supply | 39-357 | full-spectrum T5 fluorescent bulbs |
| Magenta tm 2-way caps | Millipore Sigma | C1934 | |
| Man, Rogosa, and Sharpe | Fisher Scientific | DF0881-17-5 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Micro pH probe | Thermo Scientific | 8220BNWP | |
| Micropestle | Carolina | 215828 | Also called Pellet Pestle |
| MS nutrient broth | Millipore Sigma | M5519 | Murashige and Skoog Basal Medium |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| Napa cabbage seeds | Johnny's Select Seeds | 2814G | B. rapa var pekinensis (Bilko) |
| Petri dish 100 mm x 15 mm | Fisher | FB0875712 | Used to make agar plates |
| Phosphate buffer saline | Fisher Scientific | 50-842-941 | Teknova |
| Plant tissue culture box | Sigma | Magenta GA-7 | |
| Serologial pipettes | VWR | 89130-900 | |
| Sterile dowel | Puritan | 10805-018 | Autoclave before use to sterilize |
| Sterilizing 0.2 µm filter | Nalgene | 974103 | |
| Tryptic soy agar | Fisher Scientific | DF0370-17-3 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Wide orifice pipette tips | Rainin | 17007102 | |
| Yeast, peptone and dextrose | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates |
References
- Grady, K. L., Sorensen, J. W., Stopnisek, N., Guittar, J., Shade, A. Assembly and seasonality of core phyllosphere microbiota on perennial biofuel crops. Nature Communications. 10 (1), 4135 (2019).
- Pii, Y., et al. Microbial interactions in the rhizosphere: beneficial influences of plant growth-promoting rhizobacteria on nutrient acquisition process. A review. Biology and Fertility of Soils. 51 (4), 403-415 (2015).
- Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).
- Bai, Y., et al. Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota. Nature. 528 (7582), 364-369 (2015).
- Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
- Dinu, L. D., Bach, S. Induction of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 in the phyllosphere of lettuce: a food safety risk factor. Applied and Environmental Microbiology. 77 (23), 8295-8302 (2011).
- Heaton, J. C., Jones, K. Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review. Journal of Applied Microbiology. 104 (3), 613-626 (2008).
- Bringel, F., Couée, I. Pivotal roles of phyllosphere microorganisms at the interface between plant functioning and atmospheric trace gas dynamics. Frontiers in Microbiology. 6, 486 (2015).
- Maignien, L., DeForce, E. A., Chafee, M. E., Eren, A. M., Simmons, S. L. Ecological succession and stochastic variation in the assembly of Arabidopsis thaliana phyllosphere communities. mBio. 5 (1), e00682 (2014).
- Carlström, C. I., et al. Synthetic microbiota reveal priority effects and keystone strains in the Arabidopsis phyllosphere. Nature Ecology & Evolution. 3 (10), 1445-1454 (2019).
- Meyer, K. M., Leveau, J. H. J. Microbiology of the phyllosphere: a playground for testing ecological concepts. Oecologia. 168 (3), 621-629 (2012).
- Humphrey, P. T., Nguyen, T. T., Villalobos, M. M., Whiteman, N. K. Diversity and abundance of phyllosphere bacteria are linked to insect herbivory. Molecular Ecology. 23 (6), 1497-1515 (2014).
- Williams, T. R., Marco, M. L. Phyllosphere microbiota composition and microbial community transplantation on lettuce plants grown indoors. mBio. 5 (4), e01564 (2014).
- Di Cagno, R., Coda, R., De Angelis, M., Gobbetti, M. Exploitation of vegetables and fruits through lactic acid fermentation. Food Microbiology. 33 (1), 1-10 (2013).
- Köberl, M., et al. Deciphering the microbiome shift during fermentation of medicinal plants. Scientific Reports. 9 (1), 13461 (2019).
- Yu, A. O., Leveau, J. H. J., Marco, M. L. Abundance, diversity and plant-specific adaptations of plant-associated lactic acid bacteria. Environmental Microbiology Reports. 12 (1), 16-29 (2020).
- Miller, E. R., et al. Establishment limitation constrains the abundance of lactic acid bacteria in the Napa cabbage phyllosphere. Applied and Environmental Microbiology. 85 (13), e00269 (2019).
- Stamer, J. R., Stoyla, B. O., Dunckel, B. A. Growth rates and fermentation patterns of lactic acid bacteria associated with sauerkraut fermentation. Journal of Milk and Food Technology. 34 (11), 521-525 (1971).
- Yildiz, F., Westhoff, D. Associative growth of lactic acid bacteria in cabbage juice. Journal of Food Science. 46 (3), 962-963 (1981).
- Zabat, M. A., Sano, W. H., Wurster, J. I., Cabral, D. J., Belenky, P. Microbial community analysis of sauerkraut fermentation reveals a stable and rapidly established community. Foods. 7 (5), 77 (2018).
- Lee, S. H., Jung, J. Y., Jeon, C. O. Source tracking and succession of kimchi lactic acid bacteria during fermentation. Journal of Food Science. 80 (8), M1871 (2015).
- Trivedi, P., Schenk, P. M., Wallenstein, M. D., Singh, B. K. Tiny Microbes, Big Yields: enhancing food crop production with biological solutions. Microbial Biotechnology. 10 (5), 999-1003 (2017).
- Knief, C., et al. Metaproteogenomic analysis of microbial communities in the phyllosphere and rhizosphere of rice. The ISME Journal. 6 (7), 1378-1390 (2012).
- Wuyts, S., et al. Carrot Juice Fermentations as Man-Made Microbial Ecosystems Dominated by Lactic Acid Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 84 (12), AEM.00134 (2018).
- Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
- Steinkraus, K. H. Lactic acid fermentation in the production of foods from vegetables, cereals and legumes. Antonie van Leeuwenhoek. 49 (3), 337-348 (1983).
