フィロスフィアおよび植物発酵における微生物叢の組立を研究するためのグノトバイオティクスシステム
Summary
単一の微生物種または多種微生物群集がキャベツの葉表面でどのように相互作用するかを評価することを可能にする無菌ナパキャベツの栽培方法が開発されました。滅菌野菜抽出物も提示され、植物発酵中のコミュニティ組成の変化を測定するために使用できます。
Abstract
フィロスフィアは、微生物によってコロニー形成され得る植物の地上部分であり、微生物群集のプロセスを同定するのに有用なモデルシステムである。このプロトコルは、ナパキャベツ植物のフィロスフィアにおける微生物群集ダイナミクスを研究するためのシステムを概説する。これは、焼成粘土と栄養ブロス基板を有する試験管で無菌植物を成長させる方法を説明しています。特定の微生物培養物を含む無菌植物の接種は、フィロスフィアにおける微生物の成長とコミュニティダイナミクスを測定する機会を提供する。発酵中に発生する微生物群集におけるキャベツのシフトから生成される無菌野菜抽出物の使用を通じても評価することができる。このシステムは、実験室で設定するには比較的簡単で安価であり、微生物群集の主要な生態学的な質問に対処するために使用することができます。また、フィロスフィアコミュニティの組成が植物発酵の微生物の多様性と品質にどのような影響を与えるかを理解する機会を提供します。グノトビオティックキャベツフィロスフィアコミュニティを開発するためのこのアプローチは、他の野生および農業植物種に適用することができます。
Introduction
フィロスフィアの微生物多様性は植物の健康を維持する上で重要な役割を果たし、また、植物が環境ストレス11、2、3、4、52,3,4,5に耐える能力に影響を与える可能性があります。ひいては、作物の健康は食品の安全と品質に直接影響を与える6,,7 .植物は生態系機能の役割を果たし、関連するマイクロバイオームは、植物がこれらの活動を行う能力に影響を与えるだけでなく、環境自体に直接影響を与える8.科学者たちはフィロスフィアの機能と組成を解読し始めているが、フィロスフィア微生物群集に影響を与える生態学的プロセスは99,1010を完全には理解していない。フィロスフィアマイクロバイオームは、マイクロバイオーム11の生態を研究するための優れた実験システムである。これらのコミュニティは比較的単純で、コミュニティメンバーの多くは標準のラボ メディア10、12,、13で成長できます。
発酵野菜は、フィロスフィアのコミュニティ構造が重要な結果をもたらす1つのシステムです。ザワークラウトとキムチの両方において、植物の葉(ブラッシカ種のフィロスフィア)に自然に発生する微生物は、発酵14、15,15の接種として機能する。乳酸菌(LAB)は、植物性微生物叢のユビキタスメンバーと考えられているが、フィロスフィア16では豊富に存在し得る。発酵中の強力なアバイオティクス選択は、乳酸菌が豊富に増加することを可能にする微生物群集組成の変化を駆動します。LABが成長するにつれて、彼らは発酵野菜製品17の酸性環境を作り出す乳酸を生産する。フィロスフィアと発酵の間のリンクは、マイクロバイオームがどのように構造化されているかを理解するためのモデルとして野菜を使用する機会を提供します。
私たちは、無菌ナパキャベツを栽培し、スプレーボトルを使用して特定の微生物群集でそれらを接種する方法を開発しました。これは、個々の微生物または混合コミュニティのいずれかでキャベツを均等に接種する安価で信頼性の高い方法です。無菌野菜エキス(SVE)は、赤と緑のキャベツ(ブラッシカオレラセア)とナパキャベツ(B.ラパ)の3種類のキャベツタイプ/品種から開発されています。これらのSVEsに塩を添加すると、発酵環境が再現され、発酵マイクロバイオームアセンブリの小規模かつ比較的高スループットの実験研究が可能になります。これらの方法は、フィロスフィアにおける微生物群集と、フィロスフィアにおける微生物群集のダイナミクスを植物発酵の成功にどのように結び付けることができるかを研究するために使用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
無菌ナパキャベツ植物は、ナパキャベツフィロスフィア17における乳酸菌の分散制限を研究するために使用されてきた。無菌ナパキャベツは、フィロスフィアの個々または対方向の成長をテストするためにも使用できます(図1)。無菌野菜抽出物の製造方法は、3種類のキャベツ(赤、緑、ナパ)でテストされています。これらの各 SVI は、信頼性の高い成長…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、USDA-NIFA助成金(2017-67013-26520)によって支えられていました。トレイシー・デベンポートとクレア・フォガンはテクニカルサポートを提供し、ルビー・イェとケイシー・コセッタはこの原稿の初期バージョンについて役立つコメントを提供しました。
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 20170-650 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 7-way tray tray | Sigma Magenta | T8654 | |
| Amber Round Boston Glass Bottle | GPS 712OZSPPK12BR | Ordered on Amazon.com from various suppliers | |
| Basket coffee filters | If you care | (unbleached paper) Purchased from Wholefoods | |
| Bleach (mercury-free) | Austin's | 50-010-45 | |
| Borosilicate Glass tubes | VWR | 47729-586 | |
| Calcined clay | Turface | MVP | Ordered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm |
| Cuisinart blender | Cuisinart | Cuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup | |
| Dissection scissors | 7-389-A | American Educational Products | Ordered on Amazon.com |
| Ethanol | VWR | 89125-172 | |
| Forceps | Aven | 18434 | Ordered on Amazon.com |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| KleenGuard M10 | Kimberley-Clark | 64240 | |
| Large plastic container | Rubbermaid | Ordered on Amazon.com | |
| Light racks | Gardner's Supply | 39-357 | full-spectrum T5 fluorescent bulbs |
| Magenta tm 2-way caps | Millipore Sigma | C1934 | |
| Man, Rogosa, and Sharpe | Fisher Scientific | DF0881-17-5 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Micro pH probe | Thermo Scientific | 8220BNWP | |
| Micropestle | Carolina | 215828 | Also called Pellet Pestle |
| MS nutrient broth | Millipore Sigma | M5519 | Murashige and Skoog Basal Medium |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| Napa cabbage seeds | Johnny's Select Seeds | 2814G | B. rapa var pekinensis (Bilko) |
| Petri dish 100 mm x 15 mm | Fisher | FB0875712 | Used to make agar plates |
| Phosphate buffer saline | Fisher Scientific | 50-842-941 | Teknova |
| Plant tissue culture box | Sigma | Magenta GA-7 | |
| Serologial pipettes | VWR | 89130-900 | |
| Sterile dowel | Puritan | 10805-018 | Autoclave before use to sterilize |
| Sterilizing 0.2 µm filter | Nalgene | 974103 | |
| Tryptic soy agar | Fisher Scientific | DF0370-17-3 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Wide orifice pipette tips | Rainin | 17007102 | |
| Yeast, peptone and dextrose | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates |
References
- Grady, K. L., Sorensen, J. W., Stopnisek, N., Guittar, J., Shade, A. Assembly and seasonality of core phyllosphere microbiota on perennial biofuel crops. Nature Communications. 10 (1), 4135 (2019).
- Pii, Y., et al. Microbial interactions in the rhizosphere: beneficial influences of plant growth-promoting rhizobacteria on nutrient acquisition process. A review. Biology and Fertility of Soils. 51 (4), 403-415 (2015).
- Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).
- Bai, Y., et al. Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota. Nature. 528 (7582), 364-369 (2015).
- Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
- Dinu, L. D., Bach, S. Induction of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 in the phyllosphere of lettuce: a food safety risk factor. Applied and Environmental Microbiology. 77 (23), 8295-8302 (2011).
- Heaton, J. C., Jones, K. Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review. Journal of Applied Microbiology. 104 (3), 613-626 (2008).
- Bringel, F., Couée, I. Pivotal roles of phyllosphere microorganisms at the interface between plant functioning and atmospheric trace gas dynamics. Frontiers in Microbiology. 6, 486 (2015).
- Maignien, L., DeForce, E. A., Chafee, M. E., Eren, A. M., Simmons, S. L. Ecological succession and stochastic variation in the assembly of Arabidopsis thaliana phyllosphere communities. mBio. 5 (1), e00682 (2014).
- Carlström, C. I., et al. Synthetic microbiota reveal priority effects and keystone strains in the Arabidopsis phyllosphere. Nature Ecology & Evolution. 3 (10), 1445-1454 (2019).
- Meyer, K. M., Leveau, J. H. J. Microbiology of the phyllosphere: a playground for testing ecological concepts. Oecologia. 168 (3), 621-629 (2012).
- Humphrey, P. T., Nguyen, T. T., Villalobos, M. M., Whiteman, N. K. Diversity and abundance of phyllosphere bacteria are linked to insect herbivory. Molecular Ecology. 23 (6), 1497-1515 (2014).
- Williams, T. R., Marco, M. L. Phyllosphere microbiota composition and microbial community transplantation on lettuce plants grown indoors. mBio. 5 (4), e01564 (2014).
- Di Cagno, R., Coda, R., De Angelis, M., Gobbetti, M. Exploitation of vegetables and fruits through lactic acid fermentation. Food Microbiology. 33 (1), 1-10 (2013).
- Köberl, M., et al. Deciphering the microbiome shift during fermentation of medicinal plants. Scientific Reports. 9 (1), 13461 (2019).
- Yu, A. O., Leveau, J. H. J., Marco, M. L. Abundance, diversity and plant-specific adaptations of plant-associated lactic acid bacteria. Environmental Microbiology Reports. 12 (1), 16-29 (2020).
- Miller, E. R., et al. Establishment limitation constrains the abundance of lactic acid bacteria in the Napa cabbage phyllosphere. Applied and Environmental Microbiology. 85 (13), e00269 (2019).
- Stamer, J. R., Stoyla, B. O., Dunckel, B. A. Growth rates and fermentation patterns of lactic acid bacteria associated with sauerkraut fermentation. Journal of Milk and Food Technology. 34 (11), 521-525 (1971).
- Yildiz, F., Westhoff, D. Associative growth of lactic acid bacteria in cabbage juice. Journal of Food Science. 46 (3), 962-963 (1981).
- Zabat, M. A., Sano, W. H., Wurster, J. I., Cabral, D. J., Belenky, P. Microbial community analysis of sauerkraut fermentation reveals a stable and rapidly established community. Foods. 7 (5), 77 (2018).
- Lee, S. H., Jung, J. Y., Jeon, C. O. Source tracking and succession of kimchi lactic acid bacteria during fermentation. Journal of Food Science. 80 (8), M1871 (2015).
- Trivedi, P., Schenk, P. M., Wallenstein, M. D., Singh, B. K. Tiny Microbes, Big Yields: enhancing food crop production with biological solutions. Microbial Biotechnology. 10 (5), 999-1003 (2017).
- Knief, C., et al. Metaproteogenomic analysis of microbial communities in the phyllosphere and rhizosphere of rice. The ISME Journal. 6 (7), 1378-1390 (2012).
- Wuyts, S., et al. Carrot Juice Fermentations as Man-Made Microbial Ecosystems Dominated by Lactic Acid Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 84 (12), AEM.00134 (2018).
- Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
- Steinkraus, K. H. Lactic acid fermentation in the production of foods from vegetables, cereals and legumes. Antonie van Leeuwenhoek. 49 (3), 337-348 (1983).
