Un système gnotobiotique pour l’étude de l’assemblage de microbiome dans la Phyllosphère et dans la fermentation végétale
Summary
Une méthode de culture de choux Napa sans germes a été mise au point qui permet aux chercheurs d’évaluer comment les espèces microbiennes uniques ou les communautés microbiennes multi-espèces interagissent sur les surfaces des feuilles de chou. Un extrait de légume stérile est également présenté qui peut être utilisé pour mesurer les changements dans la composition communautaire pendant la fermentation végétale.
Abstract
La phyllosphère, la partie au-dessus du sol de la plante qui peut être colonisée par des microbes, est un système modèle utile pour identifier les processus d’assemblage de la communauté microbienne. Ce protocole décrit un système d’étude de la dynamique des communautés microbiennes dans la phyllosphère des plants de choux de Napa. Il décrit comment cultiver des plantes exemptes de germes dans des tubes à essai avec un substrat d’argile calcinée et de bouillon nutritif. L’inoculation de plantes exemptes de germes ayant des cultures microbiennes spécifiques offre des possibilités de mesurer la croissance microbienne et la dynamique communautaire dans la phyllosphère. Grâce à l’utilisation d’extrait de légumes stériles produits à partir de choux, les changements dans les communautés microbiennes qui se produisent pendant la fermentation peuvent également être évalués. Ce système est relativement simple et peu coûteux à mettre en place en laboratoire et peut être utilisé pour répondre à des questions écologiques clés dans l’assemblage de la communauté microbienne. Il offre également des occasions de comprendre comment la composition de la communauté phyllosphère peut avoir un impact sur la diversité microbienne et la qualité des fermentations végétales. Cette approche pour le développement de communautés phyllosphère de chou gnotobiotique pourrait être appliquée à d’autres espèces végétales sauvages et agricoles.
Introduction
La diversité microbienne de la phyllosphère joue un rôle important dans le maintien de la santé des plantes et peut également influencer la capacité des plantes à résister au stress environnemental1,2,3,4,5. À son tour, la santé des cultures a un impact direct sur la salubrité et la qualité des aliments6,7. Les plantes jouent un rôle dans le fonctionnement de l’écosystème et leurs microbiomes associés affectent à la fois la capacité des plantes à mener à bien ces activités ainsi que d’influencer directement l’environnement eux-mêmes8. Alors que les scientifiques ont commencé à déchiffrer la fonction et la composition de la phyllosphère, les processus écologiques qui influencent l’assemblage de la communauté microbienne phyllosphère ne sont pas pleinement compris9,10. Le microbiome de phyllosphère est un excellent système expérimental pour étudier l’écologie des microbiomes11. Ces communautés sont relativement simples et bon nombre des membres de la communauté peuvent être cultivés sur les médias de laboratoire standard10,12,13.
Les légumes fermentés sont un système où la structure communautaire de la phyllosphère a des conséquences importantes. Dans la choucroute et le kimchi, les microbes qui se trouvent naturellement sur les feuilles végétales (la phyllosphère des espèces de Brassica) sert d’inoculum pour la fermentation14,15. Les bactéries lactiques (LAB) sont considérées comme des membres omniprésents des microbiomes végétaux, mais elles peuvent être en faible abondance dans la phyllosphère16. Une forte sélection abiotique pendant la fermentation entraîne un changement dans la composition de la communauté microbienne permettant aux bactéries lactiques d’augmenter en abondance. Au fur et à mesure que LAB se développe, ils produisent de l’acide lactique qui crée l’environnement acide des produits végétaux fermentés17. Le lien entre la phyllosphère et le ferment offre l’occasion d’utiliser les légumes comme modèle pour comprendre comment les microbiomes sont structurés.
Nous avons mis au point des méthodes pour cultiver des choux Napa exempts de germes et les inoculer avec des communautés microbiennes spécifiques à l’aide de bouteilles de pulvérisation. Il s’agit d’une méthode peu coûteuse et fiable d’inoculer uniformément le chou avec des microbes individuels ou des communautés mixtes. Un extrait de légumes stériles (SVE) a également été développé à partir de trois types de choux différents / variétés: chou rouge et vert (Brassica oleracea) et chou Napa (B. rapa). L’ajout de sel à ces SVE reproduit l’environnement de fermentation et permet des études expérimentales à petite échelle et à débit relativement élevé de l’assemblage du microbiome de fermentation. Ces méthodes peuvent être utilisées pour étudier l’assemblage de la communauté microbienne dans la phyllosphère et comment la dynamique de la communauté microbienne dans la phyllosphère peut être liée au succès de la fermentation végétale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les plants de choux napa exempts de germes ont été utilisés pour étudier la limitation de dispersion des bactéries lactiques dans la phyllosphère du chou napa17. Les choux napa exempts de germes peuvent également être utilisés pour tester la croissance individuelle ou en couple dans la phyllosphère (figure 1). Des méthodes de fabrication d’extrait de légumes stériles ont été testées pour trois variétés différentes de choux : le rouge, le vert et l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la subvention USDA-NIFA : 2017-67013-26520. Tracy Debenport et Claire Fogan ont fourni un soutien technique et Ruby Ye et Casey Cosetta fournissent des commentaires utiles sur les premières versions de ce manuscrit.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 20170-650 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 7-way tray tray | Sigma Magenta | T8654 | |
| Amber Round Boston Glass Bottle | GPS 712OZSPPK12BR | Ordered on Amazon.com from various suppliers | |
| Basket coffee filters | If you care | (unbleached paper) Purchased from Wholefoods | |
| Bleach (mercury-free) | Austin's | 50-010-45 | |
| Borosilicate Glass tubes | VWR | 47729-586 | |
| Calcined clay | Turface | MVP | Ordered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm |
| Cuisinart blender | Cuisinart | Cuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup | |
| Dissection scissors | 7-389-A | American Educational Products | Ordered on Amazon.com |
| Ethanol | VWR | 89125-172 | |
| Forceps | Aven | 18434 | Ordered on Amazon.com |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| KleenGuard M10 | Kimberley-Clark | 64240 | |
| Large plastic container | Rubbermaid | Ordered on Amazon.com | |
| Light racks | Gardner's Supply | 39-357 | full-spectrum T5 fluorescent bulbs |
| Magenta tm 2-way caps | Millipore Sigma | C1934 | |
| Man, Rogosa, and Sharpe | Fisher Scientific | DF0881-17-5 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Micro pH probe | Thermo Scientific | 8220BNWP | |
| Micropestle | Carolina | 215828 | Also called Pellet Pestle |
| MS nutrient broth | Millipore Sigma | M5519 | Murashige and Skoog Basal Medium |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| Napa cabbage seeds | Johnny's Select Seeds | 2814G | B. rapa var pekinensis (Bilko) |
| Petri dish 100 mm x 15 mm | Fisher | FB0875712 | Used to make agar plates |
| Phosphate buffer saline | Fisher Scientific | 50-842-941 | Teknova |
| Plant tissue culture box | Sigma | Magenta GA-7 | |
| Serologial pipettes | VWR | 89130-900 | |
| Sterile dowel | Puritan | 10805-018 | Autoclave before use to sterilize |
| Sterilizing 0.2 µm filter | Nalgene | 974103 | |
| Tryptic soy agar | Fisher Scientific | DF0370-17-3 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Wide orifice pipette tips | Rainin | 17007102 | |
| Yeast, peptone and dextrose | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates |
References
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