Hedeflenen İlaç Teslimatı için Doxorubicin Yüklü Aptamer-PEI-g-PEG Modifiye Altın Nanopartiküllerinin Sentezi
Summary
Bu protokolde, doxorubicin yüklü AS1411-g-PEI-g-PEG modifiye altın nanopartiküller üç aşamalı reaksiyonlar yoluyla sentezlenir. Daha sonra doksofobikin yüklenir ve kanser tedavisi için hedef kanser hücrelerine teslim edilir.
Abstract
Sağlıklı hücrelerde ilaç direnci ve toksisite nedeniyle klinik kanser tedavisinde doksofobisin (DOX) kullanımı sınırlanmıştır. Bu protokol, polietilen glikol (PEI-g-PEG) koaloksimer fonksiyonelleştirilmiş altın nanopartiküller (AuNP’ler) ile aşılanmış poli (etileninimin) yüklü aptamer (AS1411) ve DOX ile amid reaksiyonları yoluyla tasarlanmasını açıklar. AS1411 özellikle kanser hücrelerindeki hedefli nükleolin reseptörleri ile bağlanır, böylece DOX sağlıklı hücreler yerine kanser hücrelerini hedefler. İlk olarak, PEG karboksilatlanır, daha sonra 1H NMR analizi ile onaylanan bir PEI-g-PEG koalizör elde etmek için dallı PEI’ye aşılanır. Daha sonra, PEI-g-PEG koalizör kaplı altın nanopartiküller (PEI-g-PEG@AuNPs) sentezlenir ve DOX ve AS1411, reaksiyonlar arasında yavaş yavaş AuNP’lere bağlanır. Hazırlanan AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs çapı ~39,9 nm dir ve nanopartiküllerin su ve hücre ortamında stabil olduğunu gösteren -29,3 mV zeta potansiyeline sahiptir. Hücre sitotoksikliği tahlilleri, yeni tasarlanan DOX yüklü AuNP’lerin kanser hücrelerini (A549) öldürebildiğini göstermektedir. Bu sentez, PEI-g-PEG koalizörlerinin, aptamerlerinin ve DOX’un, sıralı amid reaksiyonları ile elde edilen AuNP’ler üzerindeki hassas düzenini göstermektedir. Bu tür aptamer-PEI-g-PEG fonksiyonelleştirilmiş AuNP’ler kanser tedavisinde hedefe yönelik ilaç teslimatı için umut verici bir platform sağlar.
Introduction
Dünya çapında en büyük halk sağlığı sorunu olan kanser, düşük kür oranı, yüksek nüks oranı ve yüksek ölüm oranı1,2. Mevcut konvansiyonel kanser karşıtı yöntemler cerrahi, kemoterapi ve radyoterapi3, kemoterapinin klinikteki kanser hastaları için birincil tedavi olduğu4. Klinik olarak kullanılan antikanser ilaçlar esas olarak paclitaxel (PTX)5 ve doxorubicin (DOX)6,7içerir. Bir antineoplastik ilaç olan DOX, kanser sitotoksisitesi ve kanser hücre çoğalmasının inhibisyonu avantajları nedeniyle klinik kemoterapide yaygın olarak uygulanmıştır8,9. Bununla birlikte, DOX kardiyotoksiteye neden olur10,11ve DOX’un kısa yarı ömrü klinikte uygulanmasını kısıtlar12. Bu nedenle, DOX’i yüklemek ve kontrollü bir şekilde hedeflenen bir alana serbest bırakmak için bozulabilir ilaç taşıyıcılarına ihtiyaç vardır.
Nanopartiküller hedefli ilaç dağıtım sistemlerinde yaygın olarak kullanılmaktadır ve kanser tedavisinde çeşitli avantajlara sahiptir (yani, büyük yüzey-hacim oranı, küçük boyut, çeşitli ilaçları kapsülleme yeteneği ve ayarlanabilir yüzey kimyası vb.) 13,14,15. Özellikle, altın nanopartiküller (AuNP’ler) fototermal kanser tedavisi16,17gibi biyolojik ve biyomedikal uygulamalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. AuNP’lerin facile sentezi ve genel yüzey fonksiyonelleştirme gibi benzersiz özellikleri, kanser tedavisinin klinik alanında mükemmel beklentilere sahiptir18. Ayrıca, AuNP’ler ilaç dağıtım stratejilerini tanımlamak, tümörleri teşhis etmek ve birçok çalışmada direnci yenmek için kullanılmıştır19,20.
Buna rağmen, AuNP’lerin, hedefleme ve erişilebilirlik özellikleri gibi gelişmiş geçirgenlik ve tutma (EPR) yoluyla tümör lezyonlarında yüksek lokal salınım yoluyla ilaç direncinin üstesinden gelmek için daha fazla uyarlanması gerekir. Polimer fonksiyonelleştirilmiş AuNP’ler, hidrofobik antikanser ilaçlarının iyileştirilmiş su çözünürlüğü ve uzun sirkülasyon süresi21,22gibi benzersiz avantajlar sergilemiştir. AuNP kaplamaları için polietilen glikol (PEG), polietilenimin (PEI), hyaluronik asit, heparin ve ksantan sakızı gibi çeşitli biyouyumlu polimerler kullanılmıştır. Daha sonra AuNP’lerin stabilitesi ve yükü iyileştirildi23. Özellikle, PEI, birincil, ikincil ve üçüncül aminlerin24’ünbirçok tekrarlayan biriminden oluşan yüksek dallı bir polimerdir. PEI mükemmel çözünürlüğe, düşük viskoziteye ve AuNP’lerde kaplama için uygun olan yüksek derecede işlevselliğe sahiptir.
Öte yandan, anti-kanser ilaçlarının doğrudan kanser hücrelerine daha iyi yükleme verimliliği ve primer ve ileri metastatik tümörlerin tedavisi için daha düşük toksisite ile teslim edilmesi gerekir25. Hedeflenen ligandlar anti-kanser ilaç hedefli doğum sistemleri için büyük bir potansiyele sahiptir26. Hedef molekül bağlama için seçiciliği, özgüllüğü hedefleyen kanser önleyici ilaçlar ve hastalıklı dokularda ilaç zenginleştirmeyi arttırır27. Daha fazla ligand antikorlar, polipeptitler ve küçük moleküller içerir. Diğer ligandlara kıyasla, nükleik asit aptamerleri in vitro olarak sentezlenebilir ve değiştirilmesi kolaydır. AS1411, özellikle kanser hücreleri 28,29,30üzerinde aşırı ifade edilmiş bir hedef nükleer protein reseptörüne bağlanmak için kararlı bir dimerik G-tetramer yapısı oluşturan değiştirilmemişbir 26bp fosfodiester oligonükleotiddir. AS1411 birçok kanser hücresinin çoğalmasını engeller, ancak sağlıklı hücrelerin büyümesini etkilemez31,32. Sonuç olarak, AS1411 ideal bir hedefli ilaç dağıtım sistemi imal etmek için kullanılmıştır.
Bu çalışmada, bir PEI-g-PEG koalolymer amid reaksiyonu ile sentezlenir, daha sonra PEI-g-PEG koalolymer kaplı altın nanopartiküller (PEI-g-PEG@AuNPs) imal edilir. Ayrıca, DOX ve AS1411, Şekil 1’degösterildiği gibi, hazırlanan PEI-g-PEG@AuNPs ardışık olarak bağlanır. Bu ayrıntılı protokol, araştırmacıların DOX ve AS1411 yüklü yeni PEI-g-PEG@AuNPs üretimiyle ilgili ortak tuzakların çoğundan kaçınmalarına yardımcı olmak için tasarlanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
1H NMR spektrumu (Şekil 2) CT-PEG koalolimer ve PEI-g-PEG koalolimerinin başarılı sentezini doğrular. PEG ve PEI’nin moleküler ağırlıkları sırasıyla 1.000 ve 1.200’dir. Ek olarak, EDC/NHS katalitik sistemi, PEI-g-PEG koalolymer’ı amid reaksiyonları yoluyla sentezlemek için kullanılmıştır. PEI-g-PEG koalizatör sentezlemek için PEG ve PEI’nin moleküler ağırlıkları değiştiyse, reaksiyon süresinin ve katalitik sistemin yeniden değerlendirilmesi gerektiği…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31700840) tarafından finanse edildi; Henan Eyaleti’nin Temel Bilimsel Araştırma Projesi (18B430013, 18A150049). Bu araştırma, XYNU’nun Genç Bilginleri için Nanhu Bursiyerleri Programı tarafından desteklendi. Yazarlar, XYNU’daki Yaşam Bilimleri Koleji’nden lisans öğrencisi Zebo Qu’ya yardımcı çalışmaları için teşekkür ediyor. Yazarlar, ekipmanlarının kullanımı için XYNU Analiz ve Test Merkezi’ni kabul etmek isterler.
Materials
| 4-Dimethylaminopyridine | Macklin | D807273 | |
| A549 cell | ATCC CCL-185TM | ||
| AS1411 | BBI Life Sciences Corporation | 5'-d (TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG) FL-AS1411 (fluorophore-labeled AS1411) | |
| Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) | SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd | ||
| Cell counting kit-8 (CCK-8) | Sigma Aldrich | 96992-500TESTS-F | |
| Dichloromethane | Traditional Chinese medicine | 80047318 | |
| Diethyl ether (Et2O) | SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd | ||
| Dimethyl sulfoxide | Macklin | D806645 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Sigma Aldrich | ||
| Doxorubicin hydrochloride | Rhawn | R017518 | |
| Ether absolute | Traditional Chinese medicine | 80059618 | |
| Field Emission Transmission Electron Microscope | FEI Company | Tecnai G2 F 20 | |
| Gold(III) chloride trihydrate | Rhawn | R016035 | |
| Laser Particle-size Instrument | Malvern Instruments Ltd | ZetasizerNanoZS/Masterszer3000E | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax 190 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride | Macklin | N808856 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Macklin | H6231 | |
| NMR software | Delta 5.2.1 | ||
| Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer | JEOL | JNM-ECZ600R/S3 | |
| Origin 8.5 | OriginLab | ||
| Penicillin | Sigma Aldrich | V900929-100ML | |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma Aldrich | 81188 | BioUltra, average Mn ~ 1000 |
| Poly (ethyleneimine) solution | Sigma Aldrich | 482595 | average Mn ~ 1200, 50 wt.% in H2O |
| Sodium borohydride, powder | Acros | C18930 | |
| Streptomycin | Sigma Aldrich | 85886-10ML | |
| Succinic anhydride | Traditional Chinese medicine | 30171826 | |
| Tetrahydrofuran | Traditional Chinese medicine | 40058161 | |
| Triethylamine | Traditional Chinese medicine | 80134318 | |
| UV/VIS/NIR Spectrometer | Lambda950 | Lambda950 | |
| X-ray Photoelectron Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | K-ALPHA 0.5EV |
References
- Abad, J. M., Bravo, I., Pariente, F., Lorenzo, E. Multi-tasking base ligand: a new concept of AuNPs synthesis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 408 (9), 2329-2338 (2016).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA-A Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
- Jang, B., Kwon, H., Katila, P., Lee, S. J., Lee, H. Dual delivery of biological therapeutics for multimodal and synergistic cancer therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 98, 113-133 (2016).
- Gansler, T., et al. Sixty years of CA: a cancer journal for clinicians. CA-A Cancer Journal for Clinicians. 60 (6), 345-350 (2010).
- Li, J., et al. Molecular Mechanism for Selective Cytotoxicity towards Cancer Cells of Diselenide-Containing Paclitaxel Nanoparticles. International Journal of Biological Sciences. 15 (8), 1755-1770 (2019).
- Zhao, D., et al. Precise ratiometric loading of PTX and DOX based on redox-sensitive mixed micelles for cancer therapy. Colloids Surfaces B: Biointerfaces. 155, 51-60 (2017).
- Blum, R. H., Carter, S. K. Adriamycin. A new anticancer drug with significant clinical activity. Annals of Internal Medicine. 80 (2), 249-259 (1974).
- de Lima, R. D. N., et al. Low-level laser therapy alleviates the deleterious effect of doxorubicin on rat adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Journal of Photochemistry Photobiology B. 196, 111512 (2019).
- Markowska, A., Kaysiewicz, J., Markowska, J., Huczynski, A. Doxycycline, salinomycin, monensin and ivermectin repositioned as cancer drugs. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 29 (13), 1549-1554 (2019).
- Songbo, M., et al. Oxidative stress injury in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Toxicology Letters. 307, 41-48 (2019).
- Ewer, M. S., Ewer, S. M. Cardiotoxicity of anticancer treatments. Nature Reviews Cardiology. 12 (9), 547-558 (2015).
- Gabizon, A., Shmeeda, H., Barenholz, Y. Pharmacokinetics of pegylated liposomal Doxorubicin: review of animal and human studies. Clinical Pharmacokinetics. 42 (5), 419-436 (2003).
- Xu, X., Ho, W., Zhang, X., Bertrand, N., Farokhzad, O. Cancer nanomedicine: from targeted delivery to combination therapy. Trends in Molecular Medicine. 21 (4), 223-232 (2015).
- Feng, S., Nie, L., Zou, P., Suo, J. Effects of drug and polymer molecular weight on drug release from PLGA-mPEG microspheres. Journal of Applied Polymer Science. 132 (6), 41431 (2015).
- Chen, D., et al. Injectable Temperature-sensitive Hydrogel with VEGF Loaded Microspheres for Vascularization and Bone Regeneration of Femoral Head Necrosis. Materials Letters. 229, 138-141 (2018).
- Abadeer, N. S., Murphy, C. J. Recent Progress in Cancer Thermal Therapy Using Gold Nanoparticles. The Journal of Physical Chemistry C. 120 (9), 4691-4716 (2016).
- Riley, R. S., Day, E. S. Gold nanoparticle-mediated photothermal therapy: applications and opportunities for multimodal cancer treatment. WIREs Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (4), 1449 (2017).
- Fratoddi, I., et al. Highly Hydrophilic Gold Nanoparticles as Carrier for Anticancer Copper(I) Complexes: Loading and Release Studies for Biomedical Applications. Nanomaterials (Basel). 9 (5), 772 (2019).
- Lee, S. M., et al. Drug-loaded gold plasmonic nanoparticles for treatment of multidrug resistance in cancer. Biomaterials. 35 (7), 2272-2282 (2014).
- Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. The golden age: gold nanoparticles for biomedicine. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2740-2779 (2012).
- Wei, T., et al. Anticancer drug nanomicelles formed by self-assembling amphiphilic dendrimer to combat cancer drug resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (10), 2978-2983 (2015).
- Galluzzi, L., Buque, A., Kepp, O., Zitvogel, L., Kroemer, G. Immunological Effects of Conventional Chemotherapy and Targeted Anticancer Agents. Cancer Cell. 28 (6), 690-714 (2015).
- Muddineti, O. S., Ghosh, B., Biswas, S. Current trends in using polymer coated gold nanoparticles for cancer therapy. International Journal of Pharmaceutics. 484 (1-2), 252-267 (2015).
- Hu, W., et al. Methyl Orange removal by a novel PEI-AuNPs-hemin nanocomposite. Journal of Environmental Sciences. 53, 278-283 (2017).
- Gu, F. X., et al. Targeted nanoparticles for cancer therapy. Nano Today. 2 (3), 14-21 (2007).
- Srinivasarao, M., Galliford, C. V., Low, P. S. Principles in the design of ligand-targeted cancer therapeutics and imaging agents. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (3), 203-219 (2015).
- Liu, Z., Shi, Y., Chen, Z., Duan, L., Wang, X. Current progress towards the use of aptamers in targeted cancer therapy. Chinese Science Bulletin (Chinese Version). 59 (14), 1267 (2014).
- Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in delivery applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (11), 1307-1315 (2008).
- Vandghanooni, S., Eskandani, M., Barar, J., Omidi, Y. Antisense LNA-loaded nanoparticles of star-shaped glucose-core PCL-PEG copolymer for enhanced inhibition of oncomiR-214 and nucleolin-mediated therapy of cisplatin-resistant ovarian cancer cells. International Journal of Pharmaceutics. 573, 118729 (2020).
- Andghanooni, S., Eskandani, M., Barar, J., Omidi, Y. AS1411 aptamer-decorated cisplatin-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) nanoparticles for targeted therapy of miR-21-inhibited ovarian cancer cells. Nanomedicine. 13 (21), 2729-2758 (2018).
- Palmieri, D., et al. Human anti-nucleolin recombinant immunoagent for cancer therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9418-9423 (2015).
- Pichiorri, F., et al. In vivo NCL targeting affects breast cancer aggressiveness through miRNA regulation. Journal of Experimental Medicine. 210 (5), 951-968 (2013).
- Hou, S., McCauley, L. K., Ma, P. X. Synthesis and erosion properties of PEG-containing polyanhydrides. Macromolecular Bioscience. 7 (5), 620-628 (2007).
- Nie, L., et al. Injectable Vaginal Hydrogels as a Multi-Drug Carrier for Contraception. Applied Sciences. 9 (8), 1638 (2019).
- Zou, P., Suo, J., Nie, L., Feng, S. Temperature-responsive biodegradable star-shaped block copolymers for vaginal gels. Journal of Materials Chemistry. 22 (13), 6316-6326 (2012).
- Etrych, T., Šubr, V., Laga, R., Říhová, B., Ulbrich, K. Polymer conjugates of doxorubicin bound through an amide and hydrazone bond: Impact of the carrier structure onto synergistic action in the treatment of solid tumours. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 58, 1-12 (2014).
- Safari, F., Tamaddon, A. M., Zarghami, N., Abolmali, S., Akbarzadeh, A. Polyelectrolyte complexes of hTERT siRNA and polyethyleneimine: Effect of degree of PEG grafting on biological and cellular activity. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 44 (6), 1561-1568 (2016).
