סינתזה של Aptamer-PEI-g-PEG שונה חלקיקי זהב טעון עם וקסורוביצ'ין עבור משלוח תרופות ממוקדות
Summary
בפרוטוקול זה, דולסורוביצ’ין טעון AS1411-g-PEI-g-PEG חלקיקי זהב שונה מסונתזים באמצעות תגובות אמיד שלושה שלבים. לאחר מכן, דוסורוביצ’ין נטען ונמסר כדי למקד תאים סרטניים לטיפול בסרטן.
Abstract
בשל עמידות לתרופות ורעילות בתאים בריאים, השימוש ב- doxorubicin (DOX) הוגבל בטיפול קליני בסרטן. פרוטוקול זה מתאר את העיצוב של פולי (אתילנימין) מושתל עם פוליאתילן גליקול (PEI-g-PEG) חלקיקי זהב פונקציונליים (AuNPs) עם aptamer טעון (AS1411) ו DOX באמצעות תגובות אמיד. AS1411 מחובר במיוחד עם קולטני גרעין ממוקדים על תאים סרטניים, כך DOX מטרות תאים סרטניים במקום תאים בריאים. ראשית, PEG הוא carboxylated, לאחר מכן מושתל PEI מסועף כדי לקבל COPolymer PEI-g-PEG, אשר אושרה על ידי ניתוח 1H NMR. לאחר מכן, חלקיקי זהב מצופים קופולימר PEI-g-PEG (PEI-g-PEG@AuNPs) מסונתזים, ו- DOX ו- AS1411 נקשרים בקובאליות ל- AuNPs בהדרגה באמצעות תגובות עמידות. הקוטר של AS1411-g-DOX-g-PEI-g-g-PEG@AuNPs מוכן הוא ~ 39.9 ננומטר, עם פוטנציאל זטה של -29.3 mV, המציין כי חלקיקים יציבים במים ובינוני תאים. מבחני ציטוטוקסיות התא מראים כי AuNPs DOX שתוכנן לאחרונה מסוגלים להרוג תאים סרטניים (A549). סינתזה זו מדגימה את הסידור העדין של קופולימרים PEI-g-PEG, aptamers, ו DOX על AuNPs מושגים על ידי תגובות אמיד רציפות. כזה aptamer-PEI-g-PEG פונקציונלי AuNPs לספק פלטפורמה מבטיחה עבור אספקת תרופות ממוקדות בטיפול בסרטן.
Introduction
בהיותו הבעיה העיקרית בבריאות הציבור ברחבי העולם, סרטן מאופיין באופן נרחב כבעל שיעור ריפוי נמוך, שיעור הישנות גבוה ושיעור תמותה גבוה1,2. השיטות הקונבנציונליות הנוכחיות נגד סרטן כוללות ניתוח, כימותרפיה והקרנות3, ביניהן כימותרפיה היא הטיפול העיקרי לחולי סרטן במרפאה4. תרופות קליניות נגד סרטן בשימוש כוללות בעיקר paclitaxel (PTX)5 ו דוקסורוביצין (DOX)6,7. DOX, תרופה אנטי-ניאופלסטית, יושמה באופן נרחב בכימותרפיה קלינית, בשל היתרונות של ציטוטוקסיות סרטן ועיכוב התפשטות תאים סרטן8,9. עם זאת, DOX גורם לב-חזה10,11, ואת זמן מחצית החיים הקצר של DOX מגביל את היישום שלה במרפאה12. לכן, נשאי תרופות מתכלים נדרשים לטעון DOX ושחרור subequently באופן מבוקר לאזור ממוקד.
חלקיקים נמצאים בשימוש נרחב במערכות משלוח תרופות ממוקדות ויש להם מספר יתרונות בטיפול בסרטן (כלומר, יחס משטח לנפח גדול, גודל קטן, היכולת לתמצת תרופות שונות, כימיית משטח מתכווננת, וכו ‘) 13,14,15. בפרט, חלקיקי זהב (AuNPs) היו בשימוש נרחב ביישומים ביולוגיים וביו-רפואיים, כגון טיפול בסרטן פוטותרמי16,17. המאפיינים הייחודיים של AuNPs, כגון סינתזת facile ופונקציונליזציה משטח כללי, יש סיכויים מצוינים בתחום הקליני של טיפול בסרטן18. כמו כן, AuNPs שימשו כדי לזהות אסטרטגיות אספקת תרופות, לאבחן גידולים, להתגבר על ההתנגדות במחקרים רבים19,20.
למרות זאת, AuNPs צריך להיות מותאם עוד יותר כדי להתגבר על עמידות לסמים באמצעות שחרור מקומי גבוה בנגעים הגידול באמצעות חדירה משופרת ושמירה (EPR), כגון תכונות מיקוד ונגישות. תרופות רב-תכליתיות פולימריות הפגינו יתרונות ייחודיים, כגון מסיסות מים משופרת של תרופות הידרופוביות נגד סרטן וזמן זרימת דם ממושך21,22. פולימרים שונים בעלי תאימות ביולוגית שימשו לציפויים של AuNP, כגון פוליאתילן גליקול (PEG), פוליאתילנימין (PEI), חומצה היאלורונית, הפרין וקסנטן גאם. ואז היציבות, כמו גם את המטען, של AuNPs הוא השתפר היטב23. באופן ספציפי, PEI הוא פולימר מסועף מאוד המורכב מיחידות חוזרות רבות של אמינים ראשוניים, משניים ושלישוניים24. PEI יש מסיסות מעולה, צמיגות נמוכה, רמה גבוהה של פונקציונליות, אשר מתאים ציפוי על AuNPs.
מצד שני, תרופות נגד סרטן צריך להיות מועבר לתאי סרטן ישירות עם יעילות טעינה משופרת, ועם רעילות נמוכה יותר לטיפול בגידולים גרורתיים ראשוניים ומתקדמים25. ligands ממוקד יש פוטנציאל גדול עבור תרופות נגד סרטן ממוקד מערכות משלוח26. הסלקטיביות שלה עבור מולקולת היעד מחייב מעניק תרופה נגד סרטן מיקוד ספציפיות ומגביר את העשרת התרופה ברקמות חולות27. ליגנדים נוספים כוללים נוגדנים, פוליפפטידים ומולקולות קטנות. בהשוואה ליגנדים אחרים, חומצת גרעין aptamers יכול להיות מסונתז במבחנה והם קלים לשינוי. AS1411 הוא אוליגונוקלאוטיד phosphodiester 26 bp ללא שינוי המהווה מבנה G-tetramer דימרי יציב לאגד במיוחד קולטן חלבון גרעיני היעד overexpressed על תאים סרטניים28,29,30. AS1411 מעכב את התפשטותם של תאים סרטניים רבים אך אינו משפיע על הצמיחה של תאים בריאים31,32. כתוצאה מכך, AS1411 שימש כדי לפברק מערכת אספקת סמים ממוקדת אידיאלית.
במחקר זה, קופולימר PEI-g-PEG מסונתז באמצעות תגובת אמיד, אז PEI-g-PEG חלקיקי זהב מצופים (PEI-g-PEG@AuNPs) הם מפוברק. בנוסף, DOX ו- AS1411 מקושרים ברצף PEG@AuNPs PEI-g-g המוכן, כפי שמוצג באיור 1. פרוטוקול מפורט זה נועד לסייע לחוקרים להימנע רבים מהמלכודות הנפוצות הקשורות לייצור PEG@AUNPS PEI-g-PEG@AuNPs חדש טעון עם DOX ו- AS1411.
Protocol
Representative Results
Discussion
ספקטרום NMR 1H (איור 2) מאשר את הסינתזה המוצלחת של קופולימר CT-PEG וקופולימר PEI-g-PEG. המשקולות המולקולריות של PEG ו-PEI היו 1,000 ו-1,200, בהתאמה. בנוסף, המערכת הקטליטית EDC / NHS שימשה לסנתז PEI-g-PEG קופולימר באמצעות תגובות אמיד. יש לציין כי אם המשקלים המולקולריים של PEG ו- PEI השתנו לסנתז PEI-g-PEG co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31700840); פרויקט המחקר המדעי המרכזי של מחוז הנאן (18B430013, 18A150049). מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המלומדים של נאנחו לחוקרים צעירים של XYNU. המחברים רוצים להודות לסטודנט לתואר ראשון זבו קו מהמכללה למדעי החיים ב- XYNU על יצירותיו המועילות. המחברים רוצים להכיר במרכז ניתוח ובדיקות של XYNU לשימוש בציוד שלהם.
Materials
| 4-Dimethylaminopyridine | Macklin | D807273 | |
| A549 cell | ATCC CCL-185TM | ||
| AS1411 | BBI Life Sciences Corporation | 5'-d (TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG) FL-AS1411 (fluorophore-labeled AS1411) | |
| Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) | SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd | ||
| Cell counting kit-8 (CCK-8) | Sigma Aldrich | 96992-500TESTS-F | |
| Dichloromethane | Traditional Chinese medicine | 80047318 | |
| Diethyl ether (Et2O) | SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd | ||
| Dimethyl sulfoxide | Macklin | D806645 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Sigma Aldrich | ||
| Doxorubicin hydrochloride | Rhawn | R017518 | |
| Ether absolute | Traditional Chinese medicine | 80059618 | |
| Field Emission Transmission Electron Microscope | FEI Company | Tecnai G2 F 20 | |
| Gold(III) chloride trihydrate | Rhawn | R016035 | |
| Laser Particle-size Instrument | Malvern Instruments Ltd | ZetasizerNanoZS/Masterszer3000E | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax 190 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride | Macklin | N808856 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Macklin | H6231 | |
| NMR software | Delta 5.2.1 | ||
| Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer | JEOL | JNM-ECZ600R/S3 | |
| Origin 8.5 | OriginLab | ||
| Penicillin | Sigma Aldrich | V900929-100ML | |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma Aldrich | 81188 | BioUltra, average Mn ~ 1000 |
| Poly (ethyleneimine) solution | Sigma Aldrich | 482595 | average Mn ~ 1200, 50 wt.% in H2O |
| Sodium borohydride, powder | Acros | C18930 | |
| Streptomycin | Sigma Aldrich | 85886-10ML | |
| Succinic anhydride | Traditional Chinese medicine | 30171826 | |
| Tetrahydrofuran | Traditional Chinese medicine | 40058161 | |
| Triethylamine | Traditional Chinese medicine | 80134318 | |
| UV/VIS/NIR Spectrometer | Lambda950 | Lambda950 | |
| X-ray Photoelectron Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | K-ALPHA 0.5EV |
References
- Abad, J. M., Bravo, I., Pariente, F., Lorenzo, E. Multi-tasking base ligand: a new concept of AuNPs synthesis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 408 (9), 2329-2338 (2016).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA-A Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
- Jang, B., Kwon, H., Katila, P., Lee, S. J., Lee, H. Dual delivery of biological therapeutics for multimodal and synergistic cancer therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 98, 113-133 (2016).
- Gansler, T., et al. Sixty years of CA: a cancer journal for clinicians. CA-A Cancer Journal for Clinicians. 60 (6), 345-350 (2010).
- Li, J., et al. Molecular Mechanism for Selective Cytotoxicity towards Cancer Cells of Diselenide-Containing Paclitaxel Nanoparticles. International Journal of Biological Sciences. 15 (8), 1755-1770 (2019).
- Zhao, D., et al. Precise ratiometric loading of PTX and DOX based on redox-sensitive mixed micelles for cancer therapy. Colloids Surfaces B: Biointerfaces. 155, 51-60 (2017).
- Blum, R. H., Carter, S. K. Adriamycin. A new anticancer drug with significant clinical activity. Annals of Internal Medicine. 80 (2), 249-259 (1974).
- de Lima, R. D. N., et al. Low-level laser therapy alleviates the deleterious effect of doxorubicin on rat adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Journal of Photochemistry Photobiology B. 196, 111512 (2019).
- Markowska, A., Kaysiewicz, J., Markowska, J., Huczynski, A. Doxycycline, salinomycin, monensin and ivermectin repositioned as cancer drugs. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 29 (13), 1549-1554 (2019).
- Songbo, M., et al. Oxidative stress injury in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Toxicology Letters. 307, 41-48 (2019).
- Ewer, M. S., Ewer, S. M. Cardiotoxicity of anticancer treatments. Nature Reviews Cardiology. 12 (9), 547-558 (2015).
- Gabizon, A., Shmeeda, H., Barenholz, Y. Pharmacokinetics of pegylated liposomal Doxorubicin: review of animal and human studies. Clinical Pharmacokinetics. 42 (5), 419-436 (2003).
- Xu, X., Ho, W., Zhang, X., Bertrand, N., Farokhzad, O. Cancer nanomedicine: from targeted delivery to combination therapy. Trends in Molecular Medicine. 21 (4), 223-232 (2015).
- Feng, S., Nie, L., Zou, P., Suo, J. Effects of drug and polymer molecular weight on drug release from PLGA-mPEG microspheres. Journal of Applied Polymer Science. 132 (6), 41431 (2015).
- Chen, D., et al. Injectable Temperature-sensitive Hydrogel with VEGF Loaded Microspheres for Vascularization and Bone Regeneration of Femoral Head Necrosis. Materials Letters. 229, 138-141 (2018).
- Abadeer, N. S., Murphy, C. J. Recent Progress in Cancer Thermal Therapy Using Gold Nanoparticles. The Journal of Physical Chemistry C. 120 (9), 4691-4716 (2016).
- Riley, R. S., Day, E. S. Gold nanoparticle-mediated photothermal therapy: applications and opportunities for multimodal cancer treatment. WIREs Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (4), 1449 (2017).
- Fratoddi, I., et al. Highly Hydrophilic Gold Nanoparticles as Carrier for Anticancer Copper(I) Complexes: Loading and Release Studies for Biomedical Applications. Nanomaterials (Basel). 9 (5), 772 (2019).
- Lee, S. M., et al. Drug-loaded gold plasmonic nanoparticles for treatment of multidrug resistance in cancer. Biomaterials. 35 (7), 2272-2282 (2014).
- Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. The golden age: gold nanoparticles for biomedicine. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2740-2779 (2012).
- Wei, T., et al. Anticancer drug nanomicelles formed by self-assembling amphiphilic dendrimer to combat cancer drug resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (10), 2978-2983 (2015).
- Galluzzi, L., Buque, A., Kepp, O., Zitvogel, L., Kroemer, G. Immunological Effects of Conventional Chemotherapy and Targeted Anticancer Agents. Cancer Cell. 28 (6), 690-714 (2015).
- Muddineti, O. S., Ghosh, B., Biswas, S. Current trends in using polymer coated gold nanoparticles for cancer therapy. International Journal of Pharmaceutics. 484 (1-2), 252-267 (2015).
- Hu, W., et al. Methyl Orange removal by a novel PEI-AuNPs-hemin nanocomposite. Journal of Environmental Sciences. 53, 278-283 (2017).
- Gu, F. X., et al. Targeted nanoparticles for cancer therapy. Nano Today. 2 (3), 14-21 (2007).
- Srinivasarao, M., Galliford, C. V., Low, P. S. Principles in the design of ligand-targeted cancer therapeutics and imaging agents. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (3), 203-219 (2015).
- Liu, Z., Shi, Y., Chen, Z., Duan, L., Wang, X. Current progress towards the use of aptamers in targeted cancer therapy. Chinese Science Bulletin (Chinese Version). 59 (14), 1267 (2014).
- Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in delivery applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (11), 1307-1315 (2008).
- Vandghanooni, S., Eskandani, M., Barar, J., Omidi, Y. Antisense LNA-loaded nanoparticles of star-shaped glucose-core PCL-PEG copolymer for enhanced inhibition of oncomiR-214 and nucleolin-mediated therapy of cisplatin-resistant ovarian cancer cells. International Journal of Pharmaceutics. 573, 118729 (2020).
- Andghanooni, S., Eskandani, M., Barar, J., Omidi, Y. AS1411 aptamer-decorated cisplatin-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) nanoparticles for targeted therapy of miR-21-inhibited ovarian cancer cells. Nanomedicine. 13 (21), 2729-2758 (2018).
- Palmieri, D., et al. Human anti-nucleolin recombinant immunoagent for cancer therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9418-9423 (2015).
- Pichiorri, F., et al. In vivo NCL targeting affects breast cancer aggressiveness through miRNA regulation. Journal of Experimental Medicine. 210 (5), 951-968 (2013).
- Hou, S., McCauley, L. K., Ma, P. X. Synthesis and erosion properties of PEG-containing polyanhydrides. Macromolecular Bioscience. 7 (5), 620-628 (2007).
- Nie, L., et al. Injectable Vaginal Hydrogels as a Multi-Drug Carrier for Contraception. Applied Sciences. 9 (8), 1638 (2019).
- Zou, P., Suo, J., Nie, L., Feng, S. Temperature-responsive biodegradable star-shaped block copolymers for vaginal gels. Journal of Materials Chemistry. 22 (13), 6316-6326 (2012).
- Etrych, T., Šubr, V., Laga, R., Říhová, B., Ulbrich, K. Polymer conjugates of doxorubicin bound through an amide and hydrazone bond: Impact of the carrier structure onto synergistic action in the treatment of solid tumours. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 58, 1-12 (2014).
- Safari, F., Tamaddon, A. M., Zarghami, N., Abolmali, S., Akbarzadeh, A. Polyelectrolyte complexes of hTERT siRNA and polyethyleneimine: Effect of degree of PEG grafting on biological and cellular activity. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 44 (6), 1561-1568 (2016).
