Synthese van Aptamer-PEI-g-PEG gemodificeerde gouden nanodeeltjes geladen met Doxorubicine voor gerichte medicijnafgifte
Summary
In dit protocol worden doxorubicine-geladen AS1411-g-PEI-g-PEG gemodificeerde gouden nanodeeltjes gesynthetiseerd via driestapsamidereacties. Vervolgens wordt doxorubicine geladen en afgeleverd om kankercellen te targeten voor kankertherapie.
Abstract
Vanwege resistentie en toxiciteit van geneesmiddelen in gezonde cellen is het gebruik van doxorubicine (DOX) beperkt in klinische kankertherapie. Dit protocol beschrijft het ontwerpen van poly(ethyleenimine) geënt met polyethyleenglycol (PEI-g-PEG) copolymeer gefunctionaliseerde gouden nanodeeltjes (AuNPs) met geladen aptamer (AS1411) en DOX door middel van amidereacties. AS1411 is specifiek gebonden met gerichte nucleolin receptoren op kankercellen, zodat DOX zich richt op kankercellen in plaats van gezonde cellen. Eerst wordt PEG carboxyleerd en vervolgens geënt op vertakte PEI om een PEI-g-PEG-copolymeer te verkrijgen, wat wordt bevestigd door 1H NMR-analyse. Vervolgens worden PEI-g-PEG copolymeer gecoate gouden nanodeeltjes (PEI-g-PEG@AuNPs) gesynthetiseerd en worden DOX en AS1411 geleidelijk via amidereacties covalent aan AuNPs gebonden. De diameter van de voorbereide AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs is ~39,9 nm, met een zetapotentiaal van -29,3 mV, wat aangeeft dat de nanodeeltjes stabiel zijn in water en celmedium. Celcytotoxiciteitstesten tonen aan dat de nieuw ontworpen DOX geladen AuNPs kankercellen kunnen doden (A549). Deze synthese toont de delicate opstelling van PEI-g-PEG copolymeren, aptamers en DOX op AuNPs die worden bereikt door sequentiële amidereacties. Dergelijke aptamer-PEI-g-PEG gefunctionaliseerde AuNPs bieden een veelbelovend platform voor gerichte medicijnafgifte in kankertherapie.
Introduction
Omdat kanker wereldwijd het grootste volksgezondheidsprobleem is, wordt kanker algemeen gekenmerkt als een laag genezingspercentage, een hoog recidiefpercentage en een hoogsterftecijfer 1,2. De huidige conventionele antikankermethoden omvatten chirurgie, chemotherapie en radiotherapie3, waaronder chemotherapie de primaire behandeling is voor kankerpatiënten in de kliniek4. Klinisch gebruikte geneesmiddelen tegen kanker omvatten voornamelijk paclitaxel (PTX)5 en doxorubicine (DOX)6,7. DOX, een antineoplastisch geneesmiddel, is breed toegepast in klinische chemotherapie, vanwege de voordelen van kankercytotoxiciteit en remming van de proliferatie van kankercellen8,9. DOX veroorzaakt echter cardiotoxiciteit10,11, en de korte halfwaardetijd van DOX beperkt de toepassing ervan in de kliniek12. Daarom zijn afbreekbare medicijndragers nodig om DOX te laden en op een gecontroleerde manier op een gecontroleerde manier vrij te geven naar een gericht gebied.
Nanodeeltjes zijn veel gebruikt in gerichte systemen voor het afleveren van geneesmiddelen en hebben verschillende voordelen bij de behandeling van kanker (d.w.z. een aanzienlijke oppervlakte-volumeverhouding, kleine grootte, vermogen om verschillende geneesmiddelen in te kapselen, en afstembare oppervlaktechemie, enz.) 13,14,15. In het bijzonder zijn gouden nanodeeltjes (AuNPs) veel gebruikt in biologische en biomedische toepassingen, zoals fotothermische kankertherapie16,17. De unieke eigenschappen van AuNPs, zoals facile synthese en algemene oppervlakte functionalisatie, hebben uitstekende vooruitzichten op het klinische gebied van kankertherapie18. Ook, AuNPs zijn gebruikt om drug levering strategieën te identificeren, tumoren te diagnosticeren, en weerstand te overwinnen in vele studies19,20.
Desondanks moeten AuNP’s verder worden aangepast om de resistentie tegen geneesmiddelen te overwinnen via een hoge lokale afgifte bij tumorlaesies door verbeterde permeatie en retentie (EPR), zoals de targeting- en toegankelijkheidseigenschappen. Polymeer gefunctionaliseerde AuNPs hebben unieke voordelen, zoals verbeterde oplosbaarheid in water van hydrofobe antikanker drugs en verlengde circulatie tijd21,22. Verschillende biocompatibele polymeren zijn gebruikt voor AuNP-coatings, zoals polyethyleenglycol (PEG), polyethyleenimine (PEI), hyaluronzuur, heparine en xanthaangom. Dan wordt de stabiliteit, evenals de lading, van AuNPs goed verbeterd23. Pei is een sterk vertakt polymeer dat bestaat uit vele herhalende eenheden van primaire, secundaire en tertiaire aminen24. PEI heeft een uitstekende oplosbaarheid, lage viscositeit en een hoge mate van functionaliteit, die geschikt is voor coating op AuNPs.
Aan de andere kant moeten antikankermedicijnen rechtstreeks aan kankercellen worden geleverd met een verbeterde laadefficiëntie en met een lagere toxiciteit voor de behandeling van primaire en gevorderde gemetastaseerde tumoren25. Gerichte liganden hebben een groot potentieel voor anti-kanker geneesmiddel gerichte toedieningssystemen26. De selectiviteit voor doelmolecuulbinding verleent antikankermedicijnen die gericht zijn op specificiteit en verhoogt de verrijking van geneesmiddelen in zieke weefsels27. Meer liganden omvatten antilichamen, polypeptiden en kleine moleculen. In vergelijking met andere liganden kunnen nucleïnezuur aptamers in vitro worden gesynthetiseerd en zijn ze gemakkelijk aan te passen. AS1411 is een ongewijzigd fosfodiëster oligonucleotide van 26 bp dat een stabiele dimerische G-tetramerstructuur vormt om zich specifiek te binden aan een overexpressie van nucleaire eiwitreceptor op kankercellen28,29,30. AS1411 remt de proliferatie van veel kankercellen , maar heeft geen invloed op de groei van gezonde cellen31,32. Als gevolg hiervan is AS1411 gebruikt om een ideaal gericht medicijnafgiftesysteem te fabriceren.
In deze studie wordt een PEI-g-PEG copolymeer gesynthetiseerd via een amidereactie, waarna PEI-g-PEG copolymeer gecoate gouden nanodeeltjes (PEI-g-PEG@AuNPs) worden vervaardigd. Bovendien zijn DOX en AS1411 opeenvolgend gekoppeld aan de voorbereide PEI-g-PEG@AuNPs, zoals weergegeven in figuur 1. Dit gedetailleerde protocol is bedoeld om onderzoekers te helpen veel van de gemeenschappelijke valkuilen te vermijden die verband houden met de fabricage van nieuwe PEI-g-PEG@AuNPs geladen met DOX en AS1411.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het 1H NMR spectrum (Figuur 2) bevestigt de succesvolle synthese van CT-PEG copolymeer en PEI-g-PEG copolymeer. De molecuulgewichten van PEG en PEI waren respectievelijk 1.000 en 1.200. Bovendien werd het EDC/NHS-katalytische systeem gebruikt om PEI-g-PEG-copolymeer te synthetiseren via amidereacties. Opgemerkt moet worden dat als de molecuulgewichten van PEG en PEI veranderen voor het synthetiseren van PEI-g-PEG-copolymeer, de reactietijd en het katalytische systeem opnieuw moete…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China (31700840); het belangrijkste wetenschappelijke onderzoeksproject van de provincie Henan (18B430013, 18A150049). Dit onderzoek werd ondersteund door het Nanhu Scholars Program for Young Scholars van XYNU. De auteurs willen bachelorstudent Zebo Qu van het College of Life Sciences in XYNU bedanken voor zijn nuttige werken. De auteurs willen graag het Analysis & Testing Center van XYNU erkennen voor het gebruik van hun apparatuur.
Materials
| 4-Dimethylaminopyridine | Macklin | D807273 | |
| A549 cell | ATCC CCL-185TM | ||
| AS1411 | BBI Life Sciences Corporation | 5'-d (TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG) FL-AS1411 (fluorophore-labeled AS1411) | |
| Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) | SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd | ||
| Cell counting kit-8 (CCK-8) | Sigma Aldrich | 96992-500TESTS-F | |
| Dichloromethane | Traditional Chinese medicine | 80047318 | |
| Diethyl ether (Et2O) | SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd | ||
| Dimethyl sulfoxide | Macklin | D806645 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Sigma Aldrich | ||
| Doxorubicin hydrochloride | Rhawn | R017518 | |
| Ether absolute | Traditional Chinese medicine | 80059618 | |
| Field Emission Transmission Electron Microscope | FEI Company | Tecnai G2 F 20 | |
| Gold(III) chloride trihydrate | Rhawn | R016035 | |
| Laser Particle-size Instrument | Malvern Instruments Ltd | ZetasizerNanoZS/Masterszer3000E | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax 190 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride | Macklin | N808856 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Macklin | H6231 | |
| NMR software | Delta 5.2.1 | ||
| Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer | JEOL | JNM-ECZ600R/S3 | |
| Origin 8.5 | OriginLab | ||
| Penicillin | Sigma Aldrich | V900929-100ML | |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma Aldrich | 81188 | BioUltra, average Mn ~ 1000 |
| Poly (ethyleneimine) solution | Sigma Aldrich | 482595 | average Mn ~ 1200, 50 wt.% in H2O |
| Sodium borohydride, powder | Acros | C18930 | |
| Streptomycin | Sigma Aldrich | 85886-10ML | |
| Succinic anhydride | Traditional Chinese medicine | 30171826 | |
| Tetrahydrofuran | Traditional Chinese medicine | 40058161 | |
| Triethylamine | Traditional Chinese medicine | 80134318 | |
| UV/VIS/NIR Spectrometer | Lambda950 | Lambda950 | |
| X-ray Photoelectron Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | K-ALPHA 0.5EV |
References
- Abad, J. M., Bravo, I., Pariente, F., Lorenzo, E. Multi-tasking base ligand: a new concept of AuNPs synthesis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 408 (9), 2329-2338 (2016).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA-A Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
- Jang, B., Kwon, H., Katila, P., Lee, S. J., Lee, H. Dual delivery of biological therapeutics for multimodal and synergistic cancer therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 98, 113-133 (2016).
- Gansler, T., et al. Sixty years of CA: a cancer journal for clinicians. CA-A Cancer Journal for Clinicians. 60 (6), 345-350 (2010).
- Li, J., et al. Molecular Mechanism for Selective Cytotoxicity towards Cancer Cells of Diselenide-Containing Paclitaxel Nanoparticles. International Journal of Biological Sciences. 15 (8), 1755-1770 (2019).
- Zhao, D., et al. Precise ratiometric loading of PTX and DOX based on redox-sensitive mixed micelles for cancer therapy. Colloids Surfaces B: Biointerfaces. 155, 51-60 (2017).
- Blum, R. H., Carter, S. K. Adriamycin. A new anticancer drug with significant clinical activity. Annals of Internal Medicine. 80 (2), 249-259 (1974).
- de Lima, R. D. N., et al. Low-level laser therapy alleviates the deleterious effect of doxorubicin on rat adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Journal of Photochemistry Photobiology B. 196, 111512 (2019).
- Markowska, A., Kaysiewicz, J., Markowska, J., Huczynski, A. Doxycycline, salinomycin, monensin and ivermectin repositioned as cancer drugs. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 29 (13), 1549-1554 (2019).
- Songbo, M., et al. Oxidative stress injury in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Toxicology Letters. 307, 41-48 (2019).
- Ewer, M. S., Ewer, S. M. Cardiotoxicity of anticancer treatments. Nature Reviews Cardiology. 12 (9), 547-558 (2015).
- Gabizon, A., Shmeeda, H., Barenholz, Y. Pharmacokinetics of pegylated liposomal Doxorubicin: review of animal and human studies. Clinical Pharmacokinetics. 42 (5), 419-436 (2003).
- Xu, X., Ho, W., Zhang, X., Bertrand, N., Farokhzad, O. Cancer nanomedicine: from targeted delivery to combination therapy. Trends in Molecular Medicine. 21 (4), 223-232 (2015).
- Feng, S., Nie, L., Zou, P., Suo, J. Effects of drug and polymer molecular weight on drug release from PLGA-mPEG microspheres. Journal of Applied Polymer Science. 132 (6), 41431 (2015).
- Chen, D., et al. Injectable Temperature-sensitive Hydrogel with VEGF Loaded Microspheres for Vascularization and Bone Regeneration of Femoral Head Necrosis. Materials Letters. 229, 138-141 (2018).
- Abadeer, N. S., Murphy, C. J. Recent Progress in Cancer Thermal Therapy Using Gold Nanoparticles. The Journal of Physical Chemistry C. 120 (9), 4691-4716 (2016).
- Riley, R. S., Day, E. S. Gold nanoparticle-mediated photothermal therapy: applications and opportunities for multimodal cancer treatment. WIREs Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (4), 1449 (2017).
- Fratoddi, I., et al. Highly Hydrophilic Gold Nanoparticles as Carrier for Anticancer Copper(I) Complexes: Loading and Release Studies for Biomedical Applications. Nanomaterials (Basel). 9 (5), 772 (2019).
- Lee, S. M., et al. Drug-loaded gold plasmonic nanoparticles for treatment of multidrug resistance in cancer. Biomaterials. 35 (7), 2272-2282 (2014).
- Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. The golden age: gold nanoparticles for biomedicine. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2740-2779 (2012).
- Wei, T., et al. Anticancer drug nanomicelles formed by self-assembling amphiphilic dendrimer to combat cancer drug resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (10), 2978-2983 (2015).
- Galluzzi, L., Buque, A., Kepp, O., Zitvogel, L., Kroemer, G. Immunological Effects of Conventional Chemotherapy and Targeted Anticancer Agents. Cancer Cell. 28 (6), 690-714 (2015).
- Muddineti, O. S., Ghosh, B., Biswas, S. Current trends in using polymer coated gold nanoparticles for cancer therapy. International Journal of Pharmaceutics. 484 (1-2), 252-267 (2015).
- Hu, W., et al. Methyl Orange removal by a novel PEI-AuNPs-hemin nanocomposite. Journal of Environmental Sciences. 53, 278-283 (2017).
- Gu, F. X., et al. Targeted nanoparticles for cancer therapy. Nano Today. 2 (3), 14-21 (2007).
- Srinivasarao, M., Galliford, C. V., Low, P. S. Principles in the design of ligand-targeted cancer therapeutics and imaging agents. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (3), 203-219 (2015).
- Liu, Z., Shi, Y., Chen, Z., Duan, L., Wang, X. Current progress towards the use of aptamers in targeted cancer therapy. Chinese Science Bulletin (Chinese Version). 59 (14), 1267 (2014).
- Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in delivery applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (11), 1307-1315 (2008).
- Vandghanooni, S., Eskandani, M., Barar, J., Omidi, Y. Antisense LNA-loaded nanoparticles of star-shaped glucose-core PCL-PEG copolymer for enhanced inhibition of oncomiR-214 and nucleolin-mediated therapy of cisplatin-resistant ovarian cancer cells. International Journal of Pharmaceutics. 573, 118729 (2020).
- Andghanooni, S., Eskandani, M., Barar, J., Omidi, Y. AS1411 aptamer-decorated cisplatin-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) nanoparticles for targeted therapy of miR-21-inhibited ovarian cancer cells. Nanomedicine. 13 (21), 2729-2758 (2018).
- Palmieri, D., et al. Human anti-nucleolin recombinant immunoagent for cancer therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9418-9423 (2015).
- Pichiorri, F., et al. In vivo NCL targeting affects breast cancer aggressiveness through miRNA regulation. Journal of Experimental Medicine. 210 (5), 951-968 (2013).
- Hou, S., McCauley, L. K., Ma, P. X. Synthesis and erosion properties of PEG-containing polyanhydrides. Macromolecular Bioscience. 7 (5), 620-628 (2007).
- Nie, L., et al. Injectable Vaginal Hydrogels as a Multi-Drug Carrier for Contraception. Applied Sciences. 9 (8), 1638 (2019).
- Zou, P., Suo, J., Nie, L., Feng, S. Temperature-responsive biodegradable star-shaped block copolymers for vaginal gels. Journal of Materials Chemistry. 22 (13), 6316-6326 (2012).
- Etrych, T., Šubr, V., Laga, R., Říhová, B., Ulbrich, K. Polymer conjugates of doxorubicin bound through an amide and hydrazone bond: Impact of the carrier structure onto synergistic action in the treatment of solid tumours. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 58, 1-12 (2014).
- Safari, F., Tamaddon, A. M., Zarghami, N., Abolmali, S., Akbarzadeh, A. Polyelectrolyte complexes of hTERT siRNA and polyethyleneimine: Effect of degree of PEG grafting on biological and cellular activity. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 44 (6), 1561-1568 (2016).
