Worm-align/Worm_CP, Caenorhabditis elegans örneklerini düzeltmek ve hizalamak ve önceki eğitim adımlarına gerek kalmadan tüm solucan görüntü tabanlı tahlilleri yapmak için kullanılabilecek basit bir FIJI/CellProfiler iş akışıdır. Solucan hizalama/Worm_CP, canlı hayvanlarda ısı şokuna bağlı ekspresyonun veya sabit numunelerdeki lipid damlacıklarının ölçülebilirhale uyguladık.
Sabit veya anestezili C. elegans görüntü verileri elde ederken sık karşılaşılan bir sorun solucanlar çapraz ve komşuları ile küme olmasıdır. Bu sorun solucanların artan yoğunluğu ile ağırlaştırılmış ve görüntüleme ve nicelik için zorluklar yaratır. C. elegans’ın ham görüntü verilerinden kullanıcı tarafından seçilen, düzleştirilmiş ve hizalanmış solucanların tek veya çok kanallı montajlarını oluşturmak için kullanılabilecek, Solucan hizalama olan FIJI tabanlı bir iş akışı geliştirdik. Solucan hizalama, kullanıcının veya çözümleme algoritmasının önceden eğitilmesini gerektirmeyen basit ve kullanıcı dostu bir iş akışıdır. Worm-align ile oluşturulan montajlar solucanların görsel denetimine, sınıflandırılmasına ve temsiline yardımcı olabilir. Buna ek olarak, Worm-align çıktısı tek solucanlarda floresan yoğunluğunun sonraki nicelikselleştirilmesi için, doğrudan FIJI’de veya diğer görüntü analizi yazılım platformlarında kullanılabilir. Bunu, Worm-align çıktısını açık kaynak hücre profili yazılımını kullanan bir boru hattı olan Worm_CP’a aktararak gösteriyoruz. CellProfiler’ın esnekliği, yüksek içerikli tarama için ek modüllerin eklenmesini sağlar. Pratik bir örnek olarak, biz iki veri kümesi üzerinde boru hattı kullandık: ilk veri seti ısı şoku indükleyici gen hsp-70organizatörü kontrolü altında yeşil floresan protein (GFP) ifade ısı şok muhabiri solucanların görüntüleri , ve ikinci veri seti sabit solucanlar elde edilen görüntüler, floresan boya ile yağ depoları için boyanmış.
Nispeten basit bir organizma, nematod C. elegans, insan hastalıkları incelemek için son derece yararlı bir model sistemidir. C. elegans genomundaki genlerin yaklaşık %38’inin insanlarda fonksiyonel benzerleri vardır1,2. C. elegans’ın benzersiz özelliklerinden biri, dokular arasında floresan muhabirlerin hücresel ekspresyonu ile ilgili in vivo bilgilere kolay erişim sağlayan optik saydam olmasıdır. Bu c. elegans görüntü tabanlı platformlar kullanarak yüksek içerikli ekranlar için bir prime model organizma yapar3. Ancak, bu çalışmaları sık sık karmaşıklaştıran bir konu, solucanların yoğun popülasyonlarını görüntülerken, çapraz lama ve kümelenme eğiliminde olmaları, tek tek solucanlar arasında karşılaştırmalar yapma, aşağı akış görüntü analizi ve nicelik bulanıklaştırma.
Bu sorunu aşmak mevcut çözümler genellikle culturing ve görüntüleme protokolü optimizasyonu güveniyor, mikro-akışkan kurulumları kullanımı yoluyla gibi4, tek solucanlar ayrı görüntülerde yakalanmasına izin5,6. Diğerleri, kümelenmiş bir popülasyonda bile tek solucanların tanınmasına olanak sağlayan makine öğrenimi algoritmaları uyguladılar. Ikincisi mükemmel bir örnek WormToolbox, açık kaynak görüntü analiz platformu, CellProfiler7modüler bir uzantısıdır. WormToolbox C. elegansanalizi için yüksek iş hacmi ve yüksek içerikli bir çözüm sunuyor , ve açıkça CellProfiler dahil yararlanır, ek analiz modülleri kolayca dahil edilebilir gibi. WormToolbox önceden eğitilmiş bir model (DefaultWormModel.xml ile birlikte gelse de, makine öğrenme algoritmasının yeniden eğitilmesi genellikle her yeni uygulama için gereklidir. Bunun nasıl yapılacıla ilgili çalışan ları Github’ da (https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/) sAtınalı ş Buna rağmen, yükleme ve WormToolbox kullanarak acemi kullanıcılar için önemli bir zaman yatırım gerektirir.
Burada, kültüre basit ve maliyet ve zaman-etkili bir protokol ve C. elegansgörüntü popülasyonları açıklar. Edinilen görüntülerde tek tek solucanların değerlendirilmesine izin vermek için Worm-align adında basit bir açık kaynak FIJI tabanlı iş akışı geliştirdik. Solucan hizalama, düzleştirilmiş ve hizalanmış solucanların tek veya çok kanallı montajlarını oluşturmak için kullanılabilir. İlk olarak, kullanıcı kafadan kuytu bir çizgi çizerek analiz için tek tek solucanları el ile seçmelidir. Solucan hizalama, seçilen solucanları genel bakışta görüntüden kırpmak için bu seçimi kullanır ve seçilen solucanların düzeltildiği ve görsel karşılaştırma ve sunum kolaylaştırmak için hizalandığı bir montaj oluşturur.
Buna ek olarak, Worm-align çıktısı tek solucanlarda floresan yoğunluğunun sonraki nicelikselleştirilmesi için, doğrudan FIJI’de veya diğer görüntü analizi yazılım platformlarında kullanılabilir. Bunu, Worm-align çıktısını açık kaynak hücre profili yazılımını kullanan bir boru hattı olan Worm_CP’a aktararak gösteriyoruz. CellProfiler’ın esnekliği, yüksek içerikli tarama için ek modüllerin eklenmesini sağlar. Biz ısı şoku tepkisi ölçmek için Worm_CP boru hattı kullandık, yüksek sıcaklık gibi stres nedeniyle yanlış katlanmış proteinleri yeniden katlanır iyi korunmuş koruyucu bir mekanizma8. Özellikle, entegre bir multi-copy transgene taşıyan solucanlar için boru hattı uygulanan, bir ısı şoku indükleyici gen organizatörü, hsp-70 (C12C8.1), yeşil floresan protein sürücüler (GFP)9. Biz de lipid damlacıkları görselleştirir bir floresan boya ile etiketlenmiş sabit hayvanlar üzerinde Worm_CP boru hattı kullandık (LDs), C. elegansana yağ depolama organel10. Bu iş akışı WormToolBox tarafından sunulan iş akışı na sahip olmasa da, görüntü tabanlı C. elegans deneylerinin görsel sunumu ve analizi için kullanıcı dostu ve basit bir alternatiftir.
Solucan hizalama, kullanıcı tarafından seçilen solucanların montajlarını kolayca oluşturan ve solucanların görsel karşılaştırma, sınıflandırma ve gösterime yardımcı olacak şekilde hizalandığı FIJI tabanlı bir görüntü işleme ardışık hattıdır. Bu özellik aynı zamanda bazı mevcut araçlar tarafından sunulsa da, özellikle CellProfiler7’dekiWormToolbox modülü, Worm-align nispeten az önceki görüntü analizi deneyimi gerektirir: Kullanıcılar sadece montaj (ve analiz) için seçmek istedikleri solucanları izlemeleri gerekir. Ham görüntü verilerindeki solucanları izlemek kolay bir işlem olsa da -özellikle dokunmatik ekranlı bir bilgisayar veya tablet mevcutolduğunda-, bu çizgilerin solucanların uzunlamasına ekseni boyunca doğru şekilde çizildiği çok önemlidir. Solucanın sadece bir kısmını takip eden eksik çizgiler, CellProfiler analizi sırasında montajda kısmi solucanlara (yani kuyruk uçlarının kafaları eksik olan solucanlara) ve kısmi segmentasyon maskelerine neden olur. Ayrıca, iki solucanın çizgileri geçerse, solucanlar solucan hizalama montajında ve floresan nicelleştirme de doğru bir şekilde işlenmeyecektir. Kalite kontrolü için, orijinal görüntüdeki satır seçimlerinin yer kaplaması görüntüsü, bir QC tablosuyla birlikte veri klasörüne kaydedilir. Bunlardan, yanlış bölümlenmiş solucanlara yol açacak sorunlu çizgiler kolayca tanımlanabilir ve montaj ve/veya sonraki analizlerin dışında tutulabilir.
Solucan seçiminde deneyciden gelen doğrudan girdi belki de biraz zaman alıcı gibi görünse de, farklı gelişim aşamalarından gelen solucanların aynı görüntüde bulunduğu deneylerde diğerleri üzerinde iş akışının açık bir avantajını sunar: Solucanlar sadece doğru gelişim aşamasındaolan solucanları özetleyerek “izleme adımı” sırasında seçilebilir. Alternatif olarak, solucanlar, hem solucanların uzunluğuna/boyutuna ilişkin güvenilir göstergeler olan izleme hattının uzunluğuna veya segmentasyon maskesinin alanına göre Worm_CP çıktıkullanılarak filtrelenebilir. Dic görüntülerindeki boyutları ve görünümleri çok farklı olduğundan, makine öğrenme algoritmalarının solucanları farklı gelişim evrelerinden tanımakta zorlanabilir.
Worm-align çıktısı, tek solucanlarda, doğrudan FIJI’de veya diğer görüntü analizi yazılım platformlarında floresan yoğunluğunun sonraki nicelikselleştirilmesi için kullanılabilir. Bunu, Worm-align boru hattını çalıştırırken seçilen solucanlarda çok kanallı floresan yoğunluğunun ölçülmesine olanak tanıyan basit bir CellProfiler boru hattına (Worm_CP) Worm-align çıktısını ithal ederek gösterdik. CellProfiler yazılımının esnekliği nedeniyle bu yaklaşımı seçtik: Tek tek solucanlardaki ek özellikleri analiz etmek için boru hattına ek modüller dahil etmek kolaydır (örn. lipid damlacıklarının boyutunun ölçülmesi veya stres granülleri, çekirdekler, mitokondri). Buna ek olarak, tek solucan maskeleri potansiyel WormToolbox7için yeni bir model eğitmek için kullanılabilir.
Bu yöntemin temel avantajları hızlı olması ve basit bir solucan montaj kurulum gerektirir. Bu yöntem yazılım işlemi öğrenme veya bir makinealgoritması7 ile eğitim setleri çalışan zaman harcama gerektirmez gibi daha hızlıdır. Ayrıca, bu yöntem ya canlı ya da sabit solucanlar sadece normal agarose pedleri üzerine monte çalışır. Diğer yöntemlerde geliştirilen karmaşık mikroakışkan odaları kullanmaya gerek yoktur5,6.
The authors have nothing to disclose.
BIOCEV’den (Prag, Çek Cumhuriyeti) Dr. Christian Lanctôt’a sabit solucanlar monte etmek için ağız mikropipet tekniğini öğrettiği için teşekkür ederiz ve Dr. Fatima Santos ve Dr Debbie Drage ağız mikropipetinde güvenlik kurulumlarını paylaştırdığımız için. Ayrıca francesca Hodge’a el yazması, Sharlene Murdoch ve Babraham Institute Facilities’e desteklerinden dolayı teşekkür ederiz. OC, ERC 638426 ve BBSRC [BBS/E/B000C0426] tarafından desteklenir.
Agarose | MeLford Biolaboratories Ltd | MB1200 | |
Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
Beaker | |||
BODIPY 493/593 | Invitrogen | D3922 | stock solution prepared in DMSO at 1mg/mL |
Centrifuge | MSE MISTRAL 1000 | ||
Conical flask | |||
Cover Slip | VWR | 631-0120 | |
Filter 0.2 µm for Syringe | Sartrius | 16534-K | Filter, to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
Isopropanol | |||
Levamisole hydrochloride | Sigma-Aldrich | BP212 | 3mM solution prepared by dissolving levamisole in M9 |
Liquid Nitrogen | Liquid Nitrogen facility | ||
Low Retention Tip 1000µL | Starlab | S1182-1830 | |
Methanol | VWR chemicals | 20847.307 | |
Microscope Slides, MENZEL GLASSER | Thermo Scientific | BS7011/2 | |
Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
Microwave Oven | Delongi | ||
M9 | prepared in the lab according to15 | ||
9cm NGM Plates | prepared in the lab according to15 | ||
PBS | prepared in the lab | ||
Protein LoBind Tube 2ml | Eppendorf | 22431102 | |
Triton | SIGMA | T9284-500ML | |
Ring Caps | SIGMA-ALDRICH | Z611247-250EA | glass micro-capillary tubes to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
Rotator | Stuart Scientific | ||
Silicone tubine translucent | Scientific Laboratory Suppliers | TSR0600200P | 6.0 mm x 2.0 mm wall – to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
Sterilized H2O | MilliQ water autoclaved in the lab | ||
10µL Tips | Starlab | S1120-3810 | |
200µL Tips | Starlab | S1120-8810 | |
1000µL Tips | Starlab | S1122-1830 | |
15mL Centrifuge Tube | CORNING | 430791 | |
Vecta Shield | VECTOR | 94010 | antifade mounting medium (H-1000) without DAPI |