ワームアライメントとWorm_CP、カエノハブディティス・エレガンスから得られた蛍光画像データの矯正と定量化のための2つのオープンソースパイプライン

このプロトコルに記載された方法に従った C.エレガンス の培養およびイメージングは、ワーム集団の大規模な概観画像を生成する。これらの画像からワームの目視検査と分類を容易にするために、ワームアラインを開発しました。ワームアラインは、単純で使いやすいフィジースクリプトで、矯正された、整列したワームのモンタージュを作成するために使用できます。ワームは、ワームの縦軸に沿って線を引くことによって、概要画像から選択されます。選択した各ワームには番号が割り当てられ、トリミングされてまっすぐになり、モンタージュに追加されます。モンタージュは、画像ごとに生成することも、元の入力フォルダからのすべての画像を組み合わせることもできます。 予想通り、パイプラインの出力は、画像の上に描画される線の品質に大きく依存します。この点を説明するために、 図 4 に、いくつかの行の例と、それらの Worm-align からの出力を示します。頭から尾の先端までの完全なラインは、適切に整列したワーム(「良い」とラベル付け)を生成します。 図 4 は、Worm-align の実行中のトレースの不正確さが、アライメントの出力にどのように影響するかを示しています。 図 4Cに示されている、説明付きのモンタージュから、次のエラーがワームの適切な配置を妨げるため、注意が必要です。 頭から尾までのワームの一貫性のないトレース(「テールからヘッド」とラベル付け)。これにより、ワームはアライメント内の異なる方向(すなわち、尾から頭、頭から尾)に向いています。 不完全なトレース (「不完全」と表示されます)。これにより、モンタージュのトリミングのためにトレースされたワームの部分のみが得られます。 1 つのトレースに複数のワームを含む (“2 つのヘッドを持つワーム” と表示されます)。これにより、ワームと近隣のネイバーがモンタージュの同じパネルに挿入されます。 画像にランダムな線を追加する(“ランダム”と表示)。これにより、モンタージュにランダムパネルが挿入されます。 モンタージュの作成では、2 つの個々の線が交差するか(「交差」とラベル付けされた)、またはワームの両端で結合されている場合(“joined”とラベル付け)、各ラインが個々のワームの全長をトレースする限り、問題ではありません: ワーム整列スクリプトは、各ラインのROI、作物、直線を個別に選択し、最終モンタージュの各パネルが単一のトレースラインを表すようにします。しかし、交差するワームの場合、モンタージュ内のワーム”intersecting1″とワーム”intersecting2″に対して完全な長さをまっすぐにしたワームが現れますが( 図5A-Bを参照)、これらのワームが元の概要画像で互いに交差していることは明らかに顕著です。したがって、’data’ サブフォルダ (図 5A)にあるオーバーレイ画像と、モンタージュ内の個々のワームのパネルから、交差する線の視覚的な識別が可能であると結論付けることができます (図 5B)。さらに、ワーム/ラインの重複は、Worm-alignによって処理された各イメージに対して生成された品質管理(QC)テーブルから識別され、データサブフォルダに保存されます。この表には、画像に描画された線の ROI ごとに 3 つのパラメータが記録されています ( 図 5Cを参照): これらの中で、 長さは 、線の ROI の長さを示します。 ワーム番号 は、概要画像に線が描画された順序を示します。最後の列は、対象のワーム/ラインと、画像で選択された他のワーム/ラインとの間に重複があるかどうかを示します。この列の番号が重なる場合は、[ ワーム番号 ] 列に表示されている番号とは異なります。オーバーレイ画像と組み合わせて、QCテーブルは、モンタージュや定量から除外されるべきワームに関する学習した決定を行うために研究者を支援する必要があります。 ワームアラインの出力は、単一ワームにおける蛍光強度のその後の定量に使用できます。フィジーでは、ライン ROI を使用して元の画像データの蛍光強度を測定できます。あるいは、ワームアライン出力をサードパーティの画像解析ソフトウェアにインポートすることもできます。この例では、CellProfiler で生成したパイプラインである Worm_CP に 2 つのデータセットのワームアライメント出力をインポートします。Worm_CPはワームアライメント出力フォルダの ‘CellProfiler’ サブフォルダ内のファイルを使用して、ワームアライメントマクロの実行中に選択された個々のワームのセグメンテーションマスクを微調整します。具体的には、ライン マスク (名前: Lines_) を使用して、バイナリ マスク (名前: Mask_) に見られるワームの集団から選択したワームを分離します。概要画像上で交差する線 (図 5A) は、モンタージュの生成に問題はないが、Worm_CPパイプラインでは問題が生じます。これがなぜそうなのかは、図 5 D-Eに示されています。Worm_CPは、個々のワームの識別を支援するために、個々の ROI ではなく、ライン マスク (図 5D)を使用します。ワームalignの実行中に 2 番目に描画される交差する線は最初のラインに重ね合わされるので、この線に沿った強度は、ライン 1 と 2 が重なるビットを含む ROI2 の強度になります。その結果、CellProfiler は 1 つのオブジェクトとしてライン 2 をセグメント化しますが、line1 は line2 と交差する場所で分離された 2 つのオブジェクトとして分割されます。これは、CellProfiler がワーム ‘intersecting1′ 用に 2 つの (半分) のワーム マスクを生成することを意味します (図 5E)。これらのイベントを最終的な解析から除外する最も簡単な方法 (必要な場合) は、QC テーブル (データ サブフォルダー) からワーム数の交差するワームを特定し、CellProfiler 出力ファイルからこれらのワームの測定値を削除することです。「フィジーと CellProfiler で必ずしも同じ番号が割り当てられる」という問題点に注意してください: CellProfiler 出力でフィジーワーム番号を識別するには、’Lines.csv’ 出力ファイルのIntensity_Max_Intensity値を確認してください。「Lines.csv」テーブルに 2 回以上画像に表示されるIntensity_Max_Intensity値は、そのライン ROI が破損したワームマスクを生成することを示します。 個々のワームマスクがセグメント化されると、Worm_CPはすべての記録されたチャネルについて選択したワームの蛍光強度を測定できます。すべての測定値は元の(生の)画像データから取得されますが、CellProfiler は自動的に 0 から 1 のスケールでピクセル強度を再スケールします。これは、生のピクセルの強度の値を画像の最大ピクセル強度で割ることによって達成されます。8 ビット イメージの場合、この値は 255 であり、16 ビット イメージの場合は 65535 です。したがって、CellProfiler の強度値は、生画像データと同等の値を取り戻すために、可能な最大強度値を掛ける必要があります。Worm_CP出力は、選択した出力フォルダーに保存される 2 つの csv ファイルである「worms.csv」と「行.csv」で構成されます。これらのファイルを検査している間、CellProfilerが蛍光強度に関連する多数のパラメータを記録していることは明らかです。このうち、Intensity_IntegratedIntensityは、ワームあたりの全蛍光(すなわち、個々のワームのマスクを仮定するすべてのピクセル内の蛍光強度の合計)に相当する。Intensity_MeanIntensityパラメータは、個々のワーム内の平均蛍光強度(すなわち、個々のワーム内に含まれるすべてのピクセルのピクセルあたりの平均蛍光強度)を指します。ワームマスクのセグメント化における(小さな)エラーの発生が時折起こるため、2つの条件間で個々のワームの蛍光測定値を比較する際にMeanIntensity測定を使用することをお勧めします。バックグラウンド蛍光を定量測定から抑制したい場合は、MeanIntensity_Thresholdという名前の測定を使用してください。 我々は、Worm_CPパイプラインを用いて、脂質滴(LD)に組み込まれた蛍光色素で標識された固定動物の蛍光強度を定量化した(図6)。ワームアライメント/Worm_CPパイプラインから蛍光定量を検証するために、WORM-align/Worm_CPパイプラインまたはフィジー/ImageJの手動定量化により、BODIPYデータセットから同じワームセットの蛍光強度を定量しました。手動定量は、各ワームを周回し、すべての画像の暗い背景ゾーンを回すことによって、フィジー/ImageJで行われました。蛍光強度をROIマネージャで測定し、画像背景について測定した値を各ワームのワーム蛍光測定から差し引いた、17を説明した。野生型(WT)N2ワームを dbl-1(nk3) 変異体と比較し、脂質滴含有量が18を減少させた。予想通り、緑の蛍光強度は、両方の方法でWTと dbl-1(nk3) ワームの間で有意に減少する(図6A,B)。アラインメントされたワームの例は 、図6C,Dで観察できます。脂質滴の含有量は、手動定量化を使用してWTと dbl-1(nk3) の間で17%(p値<0.0001、未対t検定)、およびWorm_CPパイプラインを使用して14%(p値=0.0051非対t検定)減少する。 dbl-1(nk3) で観察された脂質滴量の減少は、両方の定量方法で、文献18に従う。これは、Worm_CP CellProfiler パイプラインを使用した取得した蛍光画像の定量が手動定量に匹敵することを示しています。 また、熱ショック誘導性遺伝子hsp-70(C12C8.1)9の制御下でGFPを発現する生きたワームにおける熱ショック応答を定量化するためにWorm_CPを用いた。図7は、熱応答性hsp-70(C12C8.1)p::GFPレポーターを搭載した生きたC.エレガンスの代表的な画像を示しています。熱ストレスがない場合、ワームはGFP発現を誘発しない(図7A,B)。しかし、34°Cで30分の短い熱ショックにさらされると、それらはGFP発現を誘発する(図7C,D)。ヒートショックの有無にかかわらずGFP発現レベルを図7Eで定量化します。 現状では、Worm_CPは非常に基本的なパイプラインです。しかし、このアプローチは、個々のワームマスクのより正確なセグメンテーションを可能にし、画像から選択されたワームの蛍光強度をより正確に定量することができます。このため、このアプローチは、ラインマスクのみを使用して、フィジーでの大まかな定量化よりも好ましいです。さらに、CellProfiler には、追加の分析モジュールをパイプラインに簡単に含めることができるという利点があります。例えば、脂質滴含有量を調べるデータセットでは、Worm_CPパイプラインへの追加モジュールの挿入は、概要画像で選択されたワームの個々の液滴の脂質滴数および蛍光強度を調査することができる。 図1:口マイクロピペットの生成.ガラスキャピラリーは、ブンゼンバーナー(A)の炎の中で、細い細長い四肢(B)を提供するまで延長される。延長されたガラスの毛細管は口のマイクロピペットのアダプター部分にそれから差し込む。(C)口マイクロピペットの概略図。口マイクロピペットは、アダプターに差し込まれたガラスキャピラリーで組み立てられました。6 mm シリコーンチューブは、安全のために使用される 0.2 μm シリンジフィルターにアダプターを接続します。フィルターのもう一端は1mLフィルター先端で終わる3 mmシリコーン管に取り付けられている。実験者はフィルター先端を介して吸引することができる。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図2:ミミズペレットを囲む液体の吸引は、口マイクロピペットを用いた。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図3:アガロースパッドに敷設ワームにカバースリップを追加するには、この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図4:転写レポーター fat-7pを運ぶ生きている動物から取得した蛍光画像にワームアライメントを使用したワームアライメントを用いたワーム矯正の例:腸内のGFPと咽頭の赤い共注射マーカー(myo-2p::tdtomato)。(A)成人期の3日目に生きたワームの蛍光顕微鏡で取得した合成画像のスクリーンショット。画像はWorm_alignで開かれ、ワームアライメントを使用してワームの縦軸に沿って線が描かれました。(B)(A)と同じ画像のスクリーンショットと、ワームの軸に沿った線の良い描画と悪い描画の例を、ワームアライメントを使用してコメントしています。(C) ワームの上に描かれた線の例。Bで選択されたワームのワームアライメント出力は、緑色蛍光強度=1、露出=60ms、赤色蛍光強度=8、露光=60msの反転広視野顕微鏡(材料表参照)で20倍の目的で撮影されました。 図 5: 交差するワームに対するワームアラインを使用したワーム矯正の例() 転写レポーター FAT-7pを運ぶ成人動物の3日目の生きたワームの蛍光顕微鏡で取得した合成画像のスクリーンショット: :腸内のGFPと咽頭の赤い共注射マーカー(myo-2p:tdtomato).交差するワームには「交差1」と「交差2」のラベルが付けられており、重複していないワームには「good3」と「good4」とラベルが付きます。(B) で選択されたまっすぐなワームを表すワームアライメントによって作成されたモンタージュ (A)モンタージュでは、ワーム 1 と 2 が元の画像 (“intersecting1” と “intersecting2” と表示されたワーム) で交差していたことが分かりました。(C)ワームが交差するケースを見つけることができるワームアライメントのQCテーブルのスクリーンショット。長さ: ROI ラインの長さ;ワーム番号: 線が描画された順序;最後の列は、対象となるワーム/対象のワームと他のワームとの間に重複があるかどうかを示します。この例では、最初の生 (ワーム番号 1) のワームは、最後の列の番号 “2” で示されるように、ワーム番号 2 と重複しています。(D) A. (E) A で選択された 4 つのワームに Worm-align で描画された線のスクリーンショット A で選択された 4 つのワームに対するワームアラインによって生成されたマスクのスクリーンショットを、交差する 2 つのワームのマスクがどのようにレンダリングされているかを示します。この場合、1つではなく2つのマスクがワーム”intersecting1″に対応するようになりました。画像は、緑色の蛍光強度=1、露光=60ms、赤色蛍光強度=8、露出=60ミリ秒の反転ワイドフィールド顕微鏡(材料表参照)で20倍の目的で撮影されました。 図6:パイプラインWorm_CPは、手動定量と同じくらい正確に蛍光を定量化します。 緑色蛍光色素BODIPYと脂質滴量に対して固定され染色された若年成虫の蛍光定量の比較は、Worm_CPパイプライン(A)または手動定量(B)のいずれかを用いた緑色蛍光色素BODIPYとを有する。WTおよび dbl-1(nk3)の 脂質液滴含有量を、動物をBODIPYで固定・染色することにより監視し、脂質滴の脂肪酸に補間する(プロトコルA参照)。若い成虫動物は60%イソプロパノールで固定され、1時間のBODIPYで染色された。同じ動物群を、Worm_CPパイプライン(ステップ7参照)を使用するか、標準手順17に従って手動で定量化して定量化した。(a)Worm_CPパイプラインを用いた蛍光の定量化。WT: n=22 動物, 平均蛍光= 1.016 (A.U) ± 0.206 SD; dbl-1(nk3):n=25動物, 平均蛍光= 0.8714 (A.U) ± 0.126 SD. ペアリングされていないt検定.(B) 蛍光の手動定量化。WT: n=22動物, 平均蛍光 = 1.048 ± 0.153 SD; dbl-1(nk3): n=25動物,平均蛍光= 0.8632±0.109 SD. 非対t検定.(C, D)WT (C) および dbl-1(nk3) (D) の代表的な例またはワームアライメント出力は、ワームアライン パイプラインでまっすぐにします。画像は、緑色の蛍光強度=2、露光=60msの反転広視野顕微鏡(材料表を参照)で20倍の目的で撮影 されました。 図7:転写レポーター hsp-70(C12C8.1)p::熱ショック後のGFPを運ぶ生きたワームの蛍光画像からの蛍光定量と生きたワームのアライメントの例。(A)短い熱ショック(34°Cで30分)の場合、若年成虫を栽培温度(25°C)で回収し、3.5hポストヒートショックをイメージした。ワームアライメントパイプラインを使用したヒートショックの後、約30個のワームが定量化されました。(A-B)ヒートショックにさらされていないアラインドワームの例(C-D)hsp-70(C12C8.1)p::GFP をウォームアライメントで運ぶ熱衝撃ワームの例(E)は、熱ショックを受けずに、または熱ショック(30分間34°C)に曝露したWT若成虫のGFP平均強度(Worm_CPパラメータ:MeanIntensity_Threshold)を示す。画像は、緑色の蛍光強度=1、露光=60msの反転広視野顕微鏡(材料表を参照)上で20倍の目的で撮影されました。いいえ HS: n =12, HS: n=32.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 補足図 1: インストール後にワームアライメント マクロが見つかるフィジーの場所。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足図 2: 同じ設定で撮影したすべての画像を含むフォルダの選択このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 図 3: フィジーの出力フォルダ内の 4 つのサブフォルダの生成このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 図 4: ワームの幅を横切る線の描画とモンタージュのチャネル設定このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足図 5: 適用された設定で画像のプレビュー。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足図6:モンタージュや定量に含める目的のワームの縦軸に沿った線の描画。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 図 7:出力フォルダ内の選択したワームのモンタージュ(“整列済み”フォルダの下)このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足図 8: セル プロファイラでの以前の分析の前の画像を消去します。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足図 9: 設定.csvサブフォルダーを選択して、ワーム位置合わせ出力フォルダーから CellProfiler にメタデータをインポートするこのファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足図 10: CellProfiler パイプライン Worm_CP.cpproj は、Lines_イメージを使用して、選択したワーム (A) を 1 つにまとめ、対象のワーム (C) の単一のワーム マスクを生成します。パイプラインは、バックグラウンドの強度 (B) も測定します。csv ファイル (D) にエクスポートされるパイプライン Worm_CP.ccproj によって測定されたすべてのパラメーターの Outlook。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足図 11: Worm_CP.cpproj パイプラインの”ExportToSpreadsheet” 内の出力ファイルの選択このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。