Worm-align e Worm_CP, due pipeline open source per raddrizzare e quantificare i dati delle immagini a fluorescenza ottenuti da Caenorhabditis elegans

La coltivazione e l’imaging di C. elegans secondo il metodo descritto in questo protocollo produce grandi immagini panoramiche delle popolazioni di vermi. Per facilitare l’ispezione visiva e la classificazione dei worm da queste immagini abbiamo sviluppato l’allineamento dei vermi. Worm-align è uno script FIJI semplice e intuitivo che può essere utilizzato per creare montaggi di worm raddrizzare e allineati. I worm vengono selezionati dalle immagini panoramiche disegnando una linea lungo l’asse longitudinale dei vermi. A ogni worm selezionato viene assegnato un numero, ritagliato e raddrizzare e aggiunto a un montaggio. I montaggi possono essere generati per immagine o combinando tutte le immagini dalla cartella di input originale. Come previsto, l’output della pipeline dipende in gran parte dalla qualità delle linee disegnate sopra le immagini. Per illustrare questo punto, nella figura 4 vengono mostrati diversi esempi di linee e il loro output da Worm-align. Una linea completa dalla testa alla punta della coda produce un verme correttamente allineato (etichettato come “buono”). La figura 4 mostra anche come le imprecisioni di tracciatura durante l’esecuzione di Worm-align influenzino l’output dell’allineamento. Dal montaggio annotato incluso nella figura 4C, occorre fare attenzione a evitare i seguenti errori, in quanto ostacolano il corretto allineamento dei worm: Tracciamento incoerente del verme dalla testa alla coda (etichettato come “coda a testa”). Ciò si traduce nell’orientamento dei vermi in direzioni diverse (ad esempio, coda a testa rispetto alla testa alla coda) nell’allineamento. Tracciatura incompleta (etichettata come “incompleta”). Ciò si traduce solo nella parte del verme che è stata tracciata per essere ritagliata per il montaggio. Inclusione di più worm in un’unica traccia (etichettata come “worm con due teste”). Ciò si traduce in worm più (sezioni significative di) i loro vicini inseriti nello stesso pannello del montaggio. Aggiunta di linee casuali all’immagine (etichettata come “casuale”). Ciò si traduce nell’inserimento di pannelli casuali nel montaggio. Per la creazione del montaggio non è un problema se due singole linee si intersecano (etichettate “intersecandosi”) o vengono unite a entrambe le estremità del worm (etichettate come “unite”), purché ogni riga traccia l’intera lunghezza di un singolo worm: lo script worm-align seleziona singolarmente e seleziona in sequenza ogni RIGA ROM, la ritaglia e la raddrizza, in modo che ogni pannello nel montaggio finale rappresenti una singola traccia di riga. Nel caso dei worm intersecanti, tuttavia, sebbene i vermi raddrizzata a lunghezza intera appaiano per il worm “intersecting1” e il worm “intersecting2” nel montaggio (vedere figura 5A-B), è chiaramente evidente che questi worm si incrociano nell’immagine panoramica originale. Pertanto, si può concludere che l’identificazione visiva delle linee intersecante è possibile dall’immagine sovrapposta presente nella sottocartella ‘data’ (Figura 5A), nonché dai pannelli dei singoli worm nel montaggio (Figura 5B). Inoltre, qualsiasi sovrapposizione di worm/linee può essere identificata dalla tabella di controllo qualità (QC) generata per ogni immagine elaborata da Worm-align e salvata nella sottocartella dati. Questa tabella registra tre parametri per ciascuna delle ROI di linea disegnate nell’immagine (vedere la figura 5C): di questi, Lunghezza indica la lunghezza del ROI della linea, che è un buon indicatore delle dimensioni del worm; e il numero worm indica l’ordine in cui le linee sono state disegnate sull’immagine panoramica. Infine, l’ultima colonna indica se vi è sovrapposizione tra il worm/linea in questione e uno qualsiasi degli altri worm/linee selezionati nell’immagine. In caso di sovrapposizione, il numero in questa colonna sarà diverso da quello elencato nella colonna Numero worm. In combinazione con l’immagine sovrapposta, la tabella QC dovrebbe aiutare il ricercatore a prendere decisioni apprese su quali vermi dovrebbero essere esclusi dal montaggio e / o dalla quantificazione. L’uscita di Worm-align può essere utilizzata per la successiva quantificazione dell’intensità di fluorescenza in singoli vermi. In FIJI, le ROM di linea possono essere usate per misurare l’intensità della fluorescenza nei dati dell’immagine originale, ad esempio eseguendo il semplice script FIJI ‘ Worm-quant.ijm’, che può essere trovato anche nel repository Worm-align su Github. In alternativa, l’output worm-align può essere importato in software di analisi delle immagini di terze parti. Lo dimostra importando l’output di worm-align di due set di Worm_CP, una pipeline generata in CellProfiler. Worm_CP utilizza i file nella sottocartella ‘CellProfiler’ della cartella di output Di allineamento worm per ottimizzare le maschere di segmentazione dei singoli worm selezionati durante l’esecuzione della macro Di allineamento worm. In particolare, utilizza la maschera di linea (denominata: Lines_) per isolare i worm selezionati dalla popolazione di worm vista nella maschera binaria (denominata: Mask_). Va notato che le linee che si intersecano sull’immagine di panoramica (Figura 5A), sebbene non siano un problema per la generazione di montaggi, sono problematiche per la pipeline Worm_CP. Perché è così, è illustrato nella figura 5 D-E. Worm_CP utilizza la maschera di linea (Figura 5D) e non singole ROM per aiutare l’identificazione dei singoli worm. La linea intersecante tracciata seconda durante l’esecuzione di Worm-align è sovrapposta alla prima linea e quindi l’intensità lungo questa linea sarà quella di ROI2 anche nel bit in cui la linea 1 e 2 si sovrappongono. Di conseguenza, CellProfiler segmenterà line2 come un unico oggetto, ma line1 come due oggetti separati nel punto in cui si interseca con line2. Ciò significa che CellProfiler produrrà due (metà) maschere worm per il worm ‘intersecting1’ (Figura 5E). Il modo più semplice per escludere questi eventi dall’analisi finale (se necessario) è identificare il numero di worm intersecati dalla tabella QC (sottocartella dati) e rimuovere le misurazioni per questi worm dai file di output di CellProfiler. Si noti che ai worm non verrà necessariamente allocato lo stesso numero in FIJI e CellProfiler: per identificare il numero di worm FIJI nell’output di CellProfiler, esaminare i valori Intensity_Max_Intensity nel file di output ‘Lines.csv’. Qualsiasi Intensity_Max_Intensity valore visualizzato nella tabella ‘Linee.csv’ più di una volta per immagine è un’indicazione del ROI di quella linea con conseguente maschera worm fratturata. Una volta segmentate le singole maschere worm, Worm_CP misurare l’intensità di fluorescenza nei worm selezionati per tutti i canali registrati. Tutte le misurazioni vengono prese dai dati originali dell’immagine (non elaborati), anche se va notato che CellProfiler ridimensiona automaticamente l’intensità dei pixel su una scala 0-1. Ciò si ottiene dividendo il valore di intensità del pixel non elaborati per la massima intensità di pixel possibile per l’immagine. Nel caso di immagini a 8 bit questo valore è 255 e, nel caso di immagini a 16 bit, è 65535. I valori di intensità di CellProfiler devono quindi essere moltiplicati per il valore di intensità massimo possibile per recuperare valori equivalenti ai dati dell’immagine non elaborati. L Worm_CP’output è costituito da due file CSV, ‘worm.csv’ e ‘Lines.csv’ salvati nella cartella di output selezionata. Durante l’ispezione di questi file, è chiaro che CellProfiler registra un gran numero di parametri relativi all’intensità della fluorescenza. Di questi, il Intensity_IntegratedIntensity corrisponde alla fluorescenza totale per verme (cioè la somma dell’intensità di fluorescenza all’interno di tutti i pixel che interpretano la maschera di un singolo verme). Il parametro Intensity_MeanIntensity si riferisce all’intensità media di fluorescenza all’interno di un singolo worm (cioè l’intensità media di fluorescenza per pixel per tutti i pixel contenuti all’interno di un singolo worm). A causa dell’insorgenza occasionale di (piccoli) errori nella segmentazione delle maschere worm, si consiglia di utilizzare misurazioni MeanIntensity quando si confrontano le misurazioni della fluorescenza dei singoli worm tra due condizioni. Se si desidera sovstrare la fluorescenza di fondo da misurazioni quantificate, utilizzare i misuramenti denominati MeanIntensity_Threshold. Abbiamo utilizzato la tubazione Worm_CP per quantificare l’intensità della fluorescenza da animali fissi che sono stati etichettati con un colorante fluorescente che incorpora nelle goccioline lipidiche (LD) (Figura 6). Al fine di convalidare la quantificazione della fluorescenza dalla pipeline Worm-align/Worm_CP, abbiamo quantificato l’intensità di fluorescenza nello stesso set di worm dal set di dati BODIPY dalla pipeline Worm-align/Worm_CP o dalla quantificazione manuale in FIJI/ImageJ. La quantificazione manuale è stata eseguita in FIJI/ImageJ girando ogni verme e una zona di sfondo scura in ogni immagine. L’intensità di fluorescenza è stata misurata nel gestore del ROI e il valore misurato per lo sfondo dell’immagine è stato sottratto dalla misurazione della fluorescenza del verme di ciascun worm, comedescritto 17. Abbiamo confrontato vermi N2 di tipo selvatico (WT) con mutanti dbl-1(nk3), che presentano una diminuzione del contenuto di goccioline lipidiche18. Come previsto, l’intensità della fluorescenza verde è significativamente diminuita tra i vermi WT e dbl-1(nk3) con entrambi i metodi(Figura 6A,B). Esempi di worm allineati possono essere osservati nella figura 6C,D. Il contenuto di goccioline lipidiche viene diminuito del 17% (valore p<0,0001, test t non accoppiato) tra WT e dbl-1(nk3) utilizzando la quantificazione manuale e del 14% (p-value=0,0051 t-test non accoppiato) utilizzando la pipeline Worm_CP. La diminuzione del contenuto di goccioline lipidiche qui osservata in dbl-1(nk3) con entrambi i metodi di quantificazione è conforme alla letteratura18. Ciò dimostra che la quantificazione delle immagini di fluorescenza acquisite con la pipeline Worm_CP CellProfiler è paragonabile alla quantificazione manuale. Abbiamo anche utilizzato Worm_CP per quantificare la risposta agli shock termici nei vermi vivi che esprimono GFP sotto controllo del gene indutbile dello shock termico hsp-70(C12C8.1)9. La figura 7 mostra immagini rappresentative di C. elegans dal vivo che trasportano l’hsp-70 (C12C8.1)p::reporter GFP. In assenza di stress da calore, i vermi non inducono espressione GFP (Figura 7A,B). Tuttavia, quando i vermi sono esposti a un breve shock termico di 30 min a 34 °C, inducono espressione GFP(Figura 7C,D). I livelli di espressione della GFP con e senza shock termico sono quantificati nella figura 7E. Nella sua forma attuale, Worm_CP tratta di un gasdotto molto semplice. Tuttavia, questo approccio consente una segmentazione più accurata delle singole maschere worm, che consente una quantificazione più accurata dell’intensità di fluorescenza in quei vermi selezionati dall’immagine. Per questo motivo, preferiamo questo approccio rispetto a una quantificazione approssimativa nelle FIJI, usando solo le maschere di linea. Inoltre, CellProfiler offre il vantaggio che ulteriori moduli di analisi possono essere facilmente inclusi nella pipeline. Ad esempio, per il set di dati che esamina il contenuto di goccioline lipidiche, l’inserimento di moduli aggiuntivi nella pipeline Worm_CP potrebbe indagare i numeri di goccioline lipidiche e l’intensità di fluorescenza delle singole goccioline in quei vermi selezionati nelle immagini di panoramica. Figura 1: Generazione di una micropipetta bocca. Un capillare di vetro viene esteso nella fiamma di un bruciatore Bunsen (A), fino a quando non fornisce sottili estremità allungate (B). Il capillare in vetro esteso viene quindi collegato al pezzo dell’adattatore della micropipetta della bocca. (C) Schema di una micropipetta della bocca. La micropipetta della bocca è stata assemblata con un capillare di vetro collegato a un adattatore. Un tubo in silicone da 6 mm collega l’adattatore a un filtro siringa da 0,2 μm, utilizzato per la sicurezza. L’altra estremità del filtro è attaccata a un tubo di silicone da 3 mm che termina con una punta filtrante da 1 ml. Lo sperimentatore può aspirare tramite la punta del filtro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Aspirazione del liquido che circonda il pellet di verme, utilizzando la micropipetta della bocca. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Aggiunta del coverslip sui vermi che giace sul pad di agarosio Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Esempi di raddrizzamento del verme usando Worm-align sulle immagini di fluorescenza acquisite da animali vivi che trasportano il reporter trascrizionale fat-7p::GFP nell’intestino e un marcatore di co-iniezione rosso nella faringe (mio-2p::tdtomato). (A) Screenshot di un’immagine composita acquisita al microscopio fluorescente dei vermi vivi al giorno 3 dell’età adulta. L’immagine è stata aperta con Worm_align e le linee sono state disegnate lungo l’asse longitudinale dei vermi usando l’allineamento del verme. (B) Screenshot della stessa immagine di in (A), con esempi commentati di disegno buono e cattivo delle linee lungo l’asse dei worm, utilizzando l’allineamento del worm. (C) Esempi di linee disegnate sopra vermi che possono salire a worm allineati in modo errato. L’output di allineamento dei vermi selezionati in B. Le immagini sono state scattate con un obiettivo 20x su un microscopio widefield invertito (vedi tabella Materiali) con intensità di fluorescenza verde=1, esposizione =60 ms e intensità di fluorescenza rossa = 8, esposizione =60 ms. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Esempi di raddrizzamento dei vermi mediante l’allineamento dei worm sui worm intersecati. (A) Screenshot di un’immagine composita acquisita al microscopio fluorescente di vermi vivi al giorno 3 di animali in età adulta che trasportano il reporter trascrizionale fat-7p::GFP nell’intestino e un marcatore di co-iniezione rosso nella faringe (mio-2p::tdtomato). I vermi intersecante sono etichettati come “intersecting1” e “intersecting2”, mentre i worm non sovrapposti sono etichettati come “good3” e “good4”. (B) Montaggio creato da Worm-align che rappresenta i worm raddrizzare selezionati in (A). È evidente nel montaggio che i vermi 1 e 2 si intersecano sull’immagine originale (vermi etichettati come “intersecting1” e “intersecting2”). (C) Screenshot della tabella QC da Worm-align che consente di individuare i casi in cui i worm si intersecano. Lunghezza: lunghezza della linea ROI; numero verme: ordine in cui le linee sono state disegnate; l’ultima colonna indica se c’è una sovrapposizione tra il worm/linea di interesse e qualsiasi altro worm. In questo esempio, il worm nel primo raw (worm number1) si sovrappone al worm numero 2, come indicato dal numero “2” nell’ultima colonna. (D) Screenshot delle linee disegnate con l’allineamento del worm sui quattro worm selezionati in A. (E) Screenshot delle maschere generate da Worm-align sui quattro worm selezionati in A, che mostra come viene eseguito il rendering delle maschere per i due worm intersecati. In questo caso, due maschere invece di una sono ora corrispondenti al worm “intersecting1”. Le immagini sono state scattate con un obiettivo 20x su un microscopio widefield invertito (vedi tabella Materiali) con intensità di fluorescenza verde=1, esposizione = 60ms e intensità di fluorescenza rossa = 8, esposizione = 60 ms. Figura 6: La Worm_CP del gasdotto quantifica la fluorescenza con la precisione della quantificazione manuale. Confronto della quantificazione della fluorescenza dei vermi giovani adulti fissi e macchiati per il contenuto di goccioline lipidiche con il colorante fluorescente verde BODIPY, Worm_CP utilizzando una tubazione (A) o una quantificazione manuale (B). Il contenuto di goccioline lipidiche di WT e dbl-1 (nk3) è stato monitorato fissando e macchiando gli animali con BODIPY, che si intercala in acidi grassi di goccioline lipidiche (vedi protocollo A). I giovani animali adulti sono stati fissati con il 60% di isopropanolo e macchiati con BODIPY per 1h. Lo stesso insieme di animali è stato quantificato utilizzando il gasdotto Worm_CP (cfr. fase 7) o mediante quantificazione manuale secondo le procedure standard17. (A) Quantificazione della fluorescenza mediante Worm_CP oleodotto. WT: n=22 animali, fluorescenza media= 1,016 (UA) ± 0,206 SD; dbl-1(nk3):n=25 animali, fluorescenza media= 0,8714 (UA) ± 0,126 SD. Test t non accoppiato. (B) Quantificazione manuale della fluorescenza. WT: n=22 animali, fluorescenza media = 1,048 ± 0,153 SD; dbl-1(nk3):n=25 animali, fluorescenza media = 0,8632 ± 0,109 SD. Test t non accoppiato. (C, D) Esempio rappresentativo o output Worm-Align per gli animali WT (C) e dbl-1(nk3) (D) raddrizzare con la tubazione di allineamento dei worm. Le immagini sono state scattate con un obiettivo 20x su un microscopio widefield invertito (vedi tabella Materiali) con intensità di fluorescenza verde=2, exposure=60ms. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 7: Esempio di quantificazione della fluorescenza e allineamento dei vermi vivi da immagini a fluorescenza di vermi vivi che trasportano il reporter trascrizionale hsp-70(C12C8.1)p::GFP a seguito di shock termico. (A) A seguito di una breve scossa di calore (30 minuti a 34 °C), i vermi giovani adulti sono stati recuperati alla loro temperatura di coltivazione (25 °C) e montati, quindi sono stati chiamati 3,5 ore dopo lo shock termico. Circa 30 vermi sono stati quantificati in seguito a shock termico utilizzando la tubazione di allineamento del verme. (A-B) Esempi di vermi allineati che non sono stati esposti a shock termico. (C-D) Esempi di worm scioccati dal calore che trasportano hsp-70(C12C8.1)p::GFP usando Worm-align. (E) mostra l’intensità media GFP (parametro Worm_CP: MeanIntensity_Threshold) dei vermi giovani adulti WT coltivati, senza shock termico o all’esposizione a shock termico (34 °C per 30 minuti). Le immagini sono state scattate con un obiettivo 20x su un microscopio widefield invertito (vedi tabella Materiali) con intensità di fluorescenza verde=1, esposizione=60ms; no HS: n=12, HS: n=32. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura supplementare 1: Posizione nelle FIGI in cui è possibile trovare la macro di allineamento dei worm, una volta installata. Clicca qui per scaricare questo file. Figura supplementare 2: Selezione della cartella contenente tutte le immagini scattate con le stesse impostazioni. Clicca qui per scaricare questo file. Figura supplementare 3: Generazione di 4 sottocartelle nella cartella di output in FIJI. Clicca qui per scaricare questo file. Figura supplementare 4: disegno di una linea sulla larghezza del worm e delle impostazioni del canale per il montaggio. Clicca qui per scaricare questo file. Figura supplementare 5: Anteprima dell’immagine con le impostazioni applicate. Clicca qui per scaricare questo file. Figura supplementare 6: Disegno di una linea lungo l’asse longitudinale dei vermi di interesse da includere nel montaggio e/o nella quantificazione. Clicca qui per scaricare questo file. Figura supplementare 7: Montaggio dei worm selezionati nella cartella di output, in cartella “allineata”. Clicca qui per scaricare questo file. Figura supplementare 8: Cancellazione delle immagini precedenti dall’analisi precedente in Cell Profiler. Clicca qui per scaricare questo file. Figura supplementare 9: importazione di metadati in CellProfiler dalla cartella di output di worm-align selezionando la sottocartella Impostazioni.csv impostazioni. Clicca qui per scaricare questo file. Figura supplementare 10: la pipeline di CellProfiler Worm_CP.cpproj utilizza le immagini Lines_ per singolo worm selezionati (A) e produce maschere worm singole dei worm di interesse (C). Il gasdotto misura anche l’intensità di fondo (B). Outlook di tutti i parametri misurati dalla pipeline Worm_CP.ccproj esportati in un file CSV (D). Clicca qui per scaricare questo file. Figura supplementare 11: selezione dei file di output nel “ExportToSpreadsheet nella pipeline Worm_CP.cpproj. Clicca qui per scaricare questo file.