Un enfoque de sobremesa para la ubicación específica de la barrera hematoencefálica que se abre con ultrasonido enfocado en un modelo de rata
Summary
El ultrasonido enfocado con agentes de microburbuja puede abrir la barrera hematoencefálica de forma focal y transitoria. Esta técnica se ha utilizado para entregar una amplia gama de agentes a través de la barrera hematoencefálica. Este artículo proporciona un protocolo detallado para la entrega localizada al cerebro de roedores con o sin orientación de RMN.
Abstract
La cirugía estereotáxica es el estándar de oro para la administración localizada de fármacos y genes en el cerebro de roedores. Esta técnica tiene muchas ventajas sobre la entrega sistémica, incluyendo la localización precisa a una región cerebral objetivo y la reducción de los efectos secundarios fuera del objetivo. Sin embargo, la cirugía estereotáxica es altamente invasiva que limita su eficacia traslacional, requiere largos tiempos de recuperación y proporciona desafíos cuando se dirige a múltiples regiones cerebrales. El ultrasonido enfocado (FUS) se puede utilizar en combinación con microburbujas circulantes para abrir transitoriamente la barrera hematoencefálica (BBB) en regiones del tamaño de un milímetro. Esto permite la localización intracraneal de agentes entregados sistémicamente que normalmente no pueden cruzar el BBB. Esta técnica proporciona una alternativa no invasiva a la cirugía estereotáxica. Sin embargo, hasta la fecha esta técnica aún no ha sido ampliamente adoptada en los laboratorios de neurociencia debido al acceso limitado a equipos y métodos estandarizados. El objetivo general de este protocolo es proporcionar un enfoque de sobremesa para la apertura de FUS BBB (BBBO) que sea asequible y reproducible y, por lo tanto, pueda ser adoptado fácilmente por cualquier laboratorio.
Introduction
A pesar de los muchos descubrimientos en neurociencia básica, el número de tratamientos emergentes para trastornos neurodesarrollo y neurodegenerativos sigue siendo relativamente limitado1,2. Una comprensión más profunda de los genes, moléculas y circuitos celulares involucrados en trastornos neurológicos ha sugerido tratamientos prometedores irrealizables en los seres humanos con técnicas actuales3. Los tratamientos eficaces a menudo están limitados por la necesidad de ser penetrables en el cerebro y específicos del sitio4,5,6,7,8. Sin embargo, los métodos existentes de administración localizada de fármacos en regiones cerebrales específicas (por ejemplo, la administración mediante inyección o cánula) son invasivos y requieren una abertura que se debe hacer en el cráneo9. La invasión de esta cirugía impide el uso rutinario del parto localizado en el cerebro humano. Además, el daño tisular y las respuestas inflamatorias resultantes son confundaciones omnipresentes para estudios básicos y preclínicos que se basan en la inyección intracerebral10. La capacidad de entregar agentes no invasivas a través de la barrera hematoencefálica (BBB) y dirigirse a regiones cerebrales específicas podría tener un tremendo impacto en los tratamientos para trastornos neurológicos, al mismo tiempo que proporciona una poderosa herramienta de investigación para la investigación preclínica.
Un método de transporte dirigido a través del BBB con daño mínimo en el tejido es el ultrasonido centrado transcraneal (FUS) junto con microburbujas para abrir focal y transitoriamente el BBB11,12,13,14,15,16. Fus BBB apertura ha ganado atención reciente para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos, accidente cerebrovascular y glioma mediante la localización de terapias para dirigirse a regiones cerebrales como factores neurotróficos17,18,19,terapias génicas20,21,22,anticuerpos23,neurotransmisores24,y nanopartículas25,26,27,28,29. Con su amplia gama de aplicaciones y su naturaleza no invasiva30,31,la apertura FUS BBB es una alternativa ideal a las inyecciones intracraneales estereotáxicas rutinarias. Además, debido a su uso actual en humanos30,32,investigaciones preclínicas utilizando esta técnica pueden considerarse altamente traslacionales. Sin embargo, la apertura de FUS BBB aún no ha sido una técnica ampliamente establecida en ciencia básica e investigación preclínica debido a la falta de accesibilidad. Por lo tanto, proporcionamos un protocolo detallado para un enfoque de sobremesa para la apertura de FUS BBB como punto de partida para los laboratorios interesados en establecer esta técnica.
Estos estudios se llevaron a cabo con un transductor de ultrasonido específico FUS de respaldo de aire de alta potencia o un transductor de inmersión ultrasónico enfocado en amortiguación de baja potencia. Los transductores fueron impulsados por un amplificador de potencia de RF diseñado para cargas reactivas y un generador de funciones de sobremesa estándar. Los detalles de estos artículos se pueden encontrar en la Tabla de materiales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí describimos un enfoque de sobremesa para la apertura fus BBB asistida por microburbuja con enfoques alternativos, incluyendo, dos transductores diferentes y métodos para la segmentación intracraneal con y sin orientación de RMN. Actualmente, con el fin de establecer la apertura FUS BBB guiada por RMN en el laboratorio, existe la opción de comprar excelentes dispositivos listos para usar que proporcionan resultados altamente estandarizados y reproducibles con interfaces fáciles de usar. Sin embargo, muchos labo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada en parte por una subvención de infraestructura de investigación EPSCoR del NSF a la Universidad de Clemson (1632881). Además, esta investigación fue apoyada en parte por el Civitan International Research Center, Birmingham, AL. Los autores reconocen con gratitud el uso de los servicios e instalaciones de la Universidad de Alabama en Birmingham Small Animal Imaging Shared Facility Grant [NIH P30 CA013148]. Los autores reconocen a Rajiv Chopra por su apoyo y orientación.
Materials
| Bubble shaker | Lantheus Medical Imaging | VMIX | VIALMIX, actiation device used to activate Definity microbubbles |
| Catheter plug/ Injection cap | SAI infusion technologies | Part Number: IC | Catheter plug/ Injection cap |
| Evans blue dye | Sigma | E2129-10G | Evans blue dye |
| Function generator | Tektronix | AFG3022B | Dual channel, 250MS/s, 25MHz |
| FUS transducer, 1.1MHz | FUS Instruments | TX-110 | 1 MHz MRI-compatible spherically focused ultrasound transducer with a hydrophone |
| Heating pad for Mice and Rats | Kent Scientific | PS-03 | Heating pad- PhysioSuite for Mice and Rats |
| Infusion pump | KD Scientific | 780100 | KDS 100 Legacy Single Syringe Infusion Pump |
| Kapton tape | Gizmo Dorks | https://www.amazon.com/dp/B01N1GGKRC/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_GbR7Db56HKD91 |
Gizmo Dorks Kapton Tape (Polyimide) for 3D Printers and Printing, 8 x 8 inches, 10 Sheets per Pack |
| Low power immersion transducer, 1MHz | Olympus | V303-SU | Immersion Transducer, 1 MHz, 0.50 in. Element Diameter, Standard Case Style, Straight UHF Connector, F=0.80IN PTF |
| Magnet sets | WINOMO | https://www.amazon.com/dp/B01DJZQJBG/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_JYQ7DbM32E5QC |
WINOMO 15mm Sew In Magnetic Bag Clasps for Sewing Scrapbooking – 10 Sets |
| RF amplifier | E&I | A075 | 75W |
| Tail vein catheter | BD | 382512/ Fisher Item: NC1228513 | 24g BD Insyte Autoguard shielded IV catheters (non-winged) |
| Ultrasound contrast microbubbles | Lantheus Medical Imaging | DE4, DE16 | DEFINITY (Perflutren Lipid Microsphere) |
| Ultrasound gel | Aquasonic | https://www.amazon.com/dp/B07FPQDM4F/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_D6Q7Db3J9QP7P |
Ultrasound Gel Aquasonic 100 Transmission 1 Liter Squeeze Bottle |
| Winged infusion sets, 22ga. | Fisher Healthcare | 22-258087 | Terumo Surflo Winged Infusion Sets |
| motor controller software | N/A | N/A | custom software written in LabView for controlling the Velmex motor controller |
| runtime environment for the motor controller software | National Instruments | LabView runtime engine version 2017 or better | https://www.ni.com/en-us/support/downloads/software-products/download.labview.html |
| 3 axis Linear stage actuator (XYZ positioner) | Velmex | ||
| bolts | Velmex | MB-1 | BiSlide Bolt 1/4-20×3/4" Socket cap screw (10 pack), Qty:3 |
| motor controller | Velmex | VXM-3 | Control,3 axis programmable stepping motor control, Qty:1 |
| mounting cleats | Velmex | MC-2 | Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:6 |
| mounting cleats | Velmex | MC-2 | Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:2 |
| usb to serial converter | Velmex | VXM-USB-RS232 | USB to RS232 Serial Communication Cable 10ft, Qty:1 |
| x-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| x-axis stepper motor | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| y-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| y-axis stepper motor | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| z-axis damper | Velmex | D6CL-6.3F | D6CL Damper for Type 23 Double Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| z-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| z-axis stepper motor | Velmex | PK266-03B-P2 | Vexta Type 23T2, Double Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| 3D printable files | |||
| Immersion transducer mount and pointer | https://www.tinkercad.com/things/cRgTthGXSRq | ||
| Stereotaxic frame | https://www.tinkercad.com/things/ilynoQcdqlH | ||
| Stereotaxic frame holder | https://www.tinkercad.com/things/aZNgqhBOHAX | ||
| 9.4T small bore animal MRI | Bruker | Bruker BioSpec 94/20 | ParaVision version 5.1 |
| AAV9-hsyn-GFP | Addgene | ||
| Cream hair remover | Church & Dwight | Nair cream | |
| gadobutrol MRI contrast agent | Bayer | Gadavist (Gadobutrol, 1mM/mL) | |
| Stereotactic frame | Stoelting | #51500 | not MRI compatible |
| turnkey FUS delivery device | FUS Instruments | RK-300 | ready to use MRI compatible FUS for rodents |
References
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