Ein Benchtop-Ansatz zur standortspezifischen Blut-Hirn-Barriere-Öffnung mit fokussiertem Ultraschall in einem Rattenmodell
Summary
Fokussierter Ultraschall mit Mikroblasenmitteln kann die Blut-Hirn-Schranke fokal und vorübergehend öffnen. Diese Technik wurde verwendet, um eine breite Palette von Agenten über die Blut-Hirn-Schranke zu liefern. Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll für die lokalisierte Lieferung an das Nagetierhirn mit oder ohne MRT-Führung.
Abstract
Stereotaxic Chirurgie ist der Goldstandard für lokalisierte Medikamente und Gen-Lieferung an das Nagetier Gehirn. Diese Technik hat viele Vorteile gegenüber der systemischen Lieferung einschließlich präziser Lokalisierung auf eine Zielhirnregion und Reduzierung von Nebenwirkungen. Die stereotaxic-Chirurgie ist jedoch hochinvasiv, was ihre translationale Wirksamkeit einschränkt, lange Erholungszeiten erfordert und Herausforderungen bietet, wenn sie mehrere Hirnregionen ins Visier nimmt. Fokussierter Ultraschall (FUS) kann in Kombination mit zirkulierenden Mikroblasen verwendet werden, um die Blut-Hirn-Schranke (BBB) in millimetergroßen Regionen vorübergehend zu öffnen. Dies ermöglicht die intrakranielle Lokalisierung systemisch gelieferter Agenten, die normalerweise nicht über die BBB verfügen können. Diese Technik bietet eine nichtinvasive Alternative zur stereotaxic-Chirurgie. Bislang ist diese Technik jedoch in neurowissenschaftlichen Laboratorien aufgrund des begrenzten Zugangs zu Geräten und standardisierten Methoden noch nicht weit verbreitet. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, einen Benchtop-Ansatz für die FUS BBB-Öffnung (BBBO) zu bieten, der erschwinglich und reproduzierbar ist und daher von jedem Labor problemlos übernommen werden kann.
Introduction
Trotz der vielen Entdeckungen in der grundlegenden Neurowissenschaft, die Anzahl der neu auftretenden Behandlungen für neuroentwicklungs- und neurodegenerative Erkrankungen bleibt relativ begrenzt1,2. Ein tieferes Verständnis der Gene, Moleküle und zellulären Schaltkreise, die an neurologischen Störungen beteiligt sind, hat vielversprechende Behandlungen vorgeschlagen, die beim Menschen mit aktuellen Techniken nicht realisierbar sind3. Effektive Behandlungen sind oft durch die Notwendigkeit begrenzt, gehirndurchdringlich und standortspezifisch4,5,6,7,8. Die bestehenden Methoden der lokalisierten Medikamentenabgabe in bestimmte Hirnregionen (z. B. Die Abgabe per Injektion oder Kanüle) sind jedoch invasiv und erfordern eine Öffnung im Schädel9. Die Invasivität dieser Operation verhindert die routinemäßige Verwendung der lokalisierten Lieferung in das menschliche Gehirn. Darüber hinaus sind Gewebeschäden und die daraus resultierenden Entzündungsreaktionen allgegenwärtige Konfounds für grundlegende und präklinische Studien, die auf intracerebrale Injektion10angewiesen sind. Die Fähigkeit, nicht-invasiv Agenten über die Blut-Hirn-Schranke (BBB) zu liefern und sie auf bestimmte Hirnregionen zu zielen, könnte einen enormen Einfluss auf die Behandlung von neurologischen Störungen haben und gleichzeitig ein leistungsfähiges Prüfwerkzeug für die präklinische Forschung bieten.
Eine Methode des gezielten Transports über die BBB mit minimalen Gewebeschäden ist transkraniell fokussierter Ultraschall (FUS) zusammen mit Mikroblasen, um die BBB11,12,13,14,15,16fokal und vorübergehend zu öffnen. FUS BBB Eröffnung hat in jüngster Zeit Aufmerksamkeit für die Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, Schlaganfall und Gliom durch die Lokalisierung von Therapeutika auf Hirnregionen wie neurotrophe Faktoren17,18,19, Gentherapien20,21,22, Antikörper23, Neurotransmitter24, und Nanopartikel25,26,27,28,29. Mit seinem breiten Anwendungsspektrum und seiner nichtinvasiven Natur30,31ist die FUS BBB Öffnung eine ideale Alternative zu routinemäßigen stereotaxic intrakraniellen Injektionen. Darüber hinaus können aufgrund seiner aktuellen Anwendung beim Menschen30,32, präklinische Untersuchungen mit dieser Technik als hochgradig translational angesehen werden. Die Eröffnung der FUS BBB ist jedoch aufgrund mangelnder Zugänglichkeit noch keine weit verbreitete Technik in der Grundlagenforschung und präklinischen Forschung. Daher bieten wir ein detailliertes Protokoll für einen Benchtop-Ansatz zur Eröffnung von FUS BBB als Ausgangspunkt für Labore, die an der Etablierung dieser Technik interessiert sind.
Diese Studien wurden entweder mit einem hochleistungsluftgestützten FUS-spezifischen Ultraschallwandler oder einem mit geringer Leistung gedämpften fokussierten Ultraschall-Immerauchwandler durchgeführt. Die Messumformer wurden von einem HF-Leistungsverstärker für reaktive Lasten und einem Standard-Tischfunktionsgenerator angetrieben. Details zu diesen Artikeln finden Sie in der Tabelle der Materialien.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrieben wir einen Benchtop-Ansatz zur mikrobubbleunterstützten FUS BBB-Öffnung mit alternativen Ansätzen, einschließlich zweier verschiedener Messumformer und Methoden für intrakranielles Targeting mit und ohne MRT-Führung. Um die MRT-geführte FUS BBB-Öffnung im Labor zu etablieren, besteht derzeit die Möglichkeit, hervorragende gebrauchsfertige Geräte zu erwerben, die hochstandardisierte und reproduzierbare Ergebnisse mit benutzerfreundlichen Schnittstellen liefern. Viele Labore sind jedoch nicht auf …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde teilweise durch ein NSF EPSCoR Research Infrastructure Stipendium an die Clemson University (1632881) unterstützt. Darüber hinaus wurde diese Forschung teilweise vom Civitan International Research Center, Birmingham, AL unterstützt. Die Autoren danken der Nutzung der Dienste und Einrichtungen der University of Alabama in Birmingham Small Animal Imaging Shared Facility Grant [NIH P30 CA013148]. Die Autoren würdigen Rajiv Chopra für seine Unterstützung und Anleitung.
Materials
| Bubble shaker | Lantheus Medical Imaging | VMIX | VIALMIX, actiation device used to activate Definity microbubbles |
| Catheter plug/ Injection cap | SAI infusion technologies | Part Number: IC | Catheter plug/ Injection cap |
| Evans blue dye | Sigma | E2129-10G | Evans blue dye |
| Function generator | Tektronix | AFG3022B | Dual channel, 250MS/s, 25MHz |
| FUS transducer, 1.1MHz | FUS Instruments | TX-110 | 1 MHz MRI-compatible spherically focused ultrasound transducer with a hydrophone |
| Heating pad for Mice and Rats | Kent Scientific | PS-03 | Heating pad- PhysioSuite for Mice and Rats |
| Infusion pump | KD Scientific | 780100 | KDS 100 Legacy Single Syringe Infusion Pump |
| Kapton tape | Gizmo Dorks | https://www.amazon.com/dp/B01N1GGKRC/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_GbR7Db56HKD91 |
Gizmo Dorks Kapton Tape (Polyimide) for 3D Printers and Printing, 8 x 8 inches, 10 Sheets per Pack |
| Low power immersion transducer, 1MHz | Olympus | V303-SU | Immersion Transducer, 1 MHz, 0.50 in. Element Diameter, Standard Case Style, Straight UHF Connector, F=0.80IN PTF |
| Magnet sets | WINOMO | https://www.amazon.com/dp/B01DJZQJBG/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_JYQ7DbM32E5QC |
WINOMO 15mm Sew In Magnetic Bag Clasps for Sewing Scrapbooking – 10 Sets |
| RF amplifier | E&I | A075 | 75W |
| Tail vein catheter | BD | 382512/ Fisher Item: NC1228513 | 24g BD Insyte Autoguard shielded IV catheters (non-winged) |
| Ultrasound contrast microbubbles | Lantheus Medical Imaging | DE4, DE16 | DEFINITY (Perflutren Lipid Microsphere) |
| Ultrasound gel | Aquasonic | https://www.amazon.com/dp/B07FPQDM4F/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_D6Q7Db3J9QP7P |
Ultrasound Gel Aquasonic 100 Transmission 1 Liter Squeeze Bottle |
| Winged infusion sets, 22ga. | Fisher Healthcare | 22-258087 | Terumo Surflo Winged Infusion Sets |
| motor controller software | N/A | N/A | custom software written in LabView for controlling the Velmex motor controller |
| runtime environment for the motor controller software | National Instruments | LabView runtime engine version 2017 or better | https://www.ni.com/en-us/support/downloads/software-products/download.labview.html |
| 3 axis Linear stage actuator (XYZ positioner) | Velmex | ||
| bolts | Velmex | MB-1 | BiSlide Bolt 1/4-20×3/4" Socket cap screw (10 pack), Qty:3 |
| motor controller | Velmex | VXM-3 | Control,3 axis programmable stepping motor control, Qty:1 |
| mounting cleats | Velmex | MC-2 | Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:6 |
| mounting cleats | Velmex | MC-2 | Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:2 |
| usb to serial converter | Velmex | VXM-USB-RS232 | USB to RS232 Serial Communication Cable 10ft, Qty:1 |
| x-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| x-axis stepper motor | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| y-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| y-axis stepper motor | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| z-axis damper | Velmex | D6CL-6.3F | D6CL Damper for Type 23 Double Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| z-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| z-axis stepper motor | Velmex | PK266-03B-P2 | Vexta Type 23T2, Double Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| 3D printable files | |||
| Immersion transducer mount and pointer | https://www.tinkercad.com/things/cRgTthGXSRq | ||
| Stereotaxic frame | https://www.tinkercad.com/things/ilynoQcdqlH | ||
| Stereotaxic frame holder | https://www.tinkercad.com/things/aZNgqhBOHAX | ||
| 9.4T small bore animal MRI | Bruker | Bruker BioSpec 94/20 | ParaVision version 5.1 |
| AAV9-hsyn-GFP | Addgene | ||
| Cream hair remover | Church & Dwight | Nair cream | |
| gadobutrol MRI contrast agent | Bayer | Gadavist (Gadobutrol, 1mM/mL) | |
| Stereotactic frame | Stoelting | #51500 | not MRI compatible |
| turnkey FUS delivery device | FUS Instruments | RK-300 | ready to use MRI compatible FUS for rodents |
References
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