Une approche benchtop à l’ouverture spécifique de barrière de cerveau de sang d’emplacement utilisant l’ultrason focal dans un modèle de rat
Summary
L’ultrason focal avec des agents de microbubble peut ouvrir la barrière de cerveau de sang focalement et transitoirement. Cette technique a été utilisée pour délivrer un large éventail d’agents à travers la barrière cérébrale. Cet article fournit un protocole détaillé pour la livraison localisée au cerveau de rongeur avec ou sans guidage de MRI.
Abstract
La chirurgie stéréotaxique est l’étalon-or pour la livraison localisée de médicaments et de gènes au cerveau des rongeurs. Cette technique présente de nombreux avantages par rapport à la livraison systémique, y compris la localisation précise d’une région cérébrale cible et la réduction des effets secondaires hors cible. Cependant, la chirurgie stéréotaxique est très invasive qui limite son efficacité translationnelle, nécessite de longs temps de récupération, et fournit des défis lors du ciblage de plusieurs régions du cerveau. L’ultrason focalisée (FUS) peut être employé en combination avec les microbubbles circulants pour ouvrir transitoirement la barrière de cerveau de sang (BBB) dans les régions millimétriques de taille. Cela permet la localisation intracrânienne des agents livrés de façon systémique qui ne peuvent normalement pas traverser le BBB. Cette technique fournit une alternative non invasive à la chirurgie stéréotaxique. Toutefois, à ce jour, cette technique n’a pas encore été largement adoptée dans les laboratoires de neurosciences en raison de l’accès limité à l’équipement et aux méthodes normalisées. L’objectif global de ce protocole est d’offrir une approche de banc à fus bbb ouverture (BBBO) qui est abordable et reproductible et peut donc être facilement adopté par n’importe quel laboratoire.
Introduction
Malgré les nombreuses découvertes en neurosciences fondamentales, le nombre de traitements émergents pour les troubles neurodéveloppementaux et neurodégénératifsreste relativement limité 1,2. Une meilleure compréhension des gènes, des molécules et des circuits cellulaires impliqués dans les troubles neurologiques a suggéré des traitements prometteurs irréalisables chez l’homme avec les techniques actuelles3. Les traitements efficaces sont souvent limités par la nécessité d’être pénétrables du cerveau et spécifiques au site4,5,6,7,8. Cependant, les méthodes existantes d’administration localisée de médicaments dans des régions spécifiques du cerveau (p. ex., l’administration par injection ou canule) sont invasives et nécessitent une ouverture dans le crâne9. L’invasivité de cette chirurgie empêche l’utilisation systématique de l’accouchement localisé dans le cerveau humain. En outre, les dommages de tissu et les réponses inflammatoires résultantes sont des confusions omniprésentes pour des études fondamentales et précliniques qui s’appuient sur l’injection intracerbrale10. La capacité de délivrer non invasivement des agents à travers la barrière cérébrale (BBB) et de les cibler vers des régions cérébrales spécifiques pourrait avoir un impact énorme sur les traitements pour les troubles neurologiques, tout en fournissant un puissant outil d’investigation pour la recherche préclinique.
Une méthode de transport ciblé à travers le BBB avec des lésions tissulaires minimales est l’échographie transcrânienne focalisée (FUS) ainsi que des microbobbles pour ouvrir focalement et transitoirement le BBB11,12,13,14,15,16. Fus BBB ouverture a attiré l’attention récente pour le traitement des troubles neurodégénératifs, accident vasculaire cérébral et gliome en localisant des thérapeutiques pour cibler les régions du cerveau tels que les facteurs neurotrophiques17,18 , 19, thérapiesgéniques 20,21,22, anticorps23, neurotransmetteurs24, et nanoparticules25,26,27,28,29. Avec sa large gamme d’applications et sa nature non invasive30,31, FUS BBB ouverture est une alternative idéale aux injections intracrâniens stéréotaxiques de routine. En outre, en raison de son utilisation actuelle chezl’homme 30,32, les investigations précliniques utilisant cette technique peuvent être considérées comme hautement translationnelles. Toutefois, l’ouverture du FUS BBB n’a pas encore été une technique largement établie en sciences fondamentales et en recherche préclinique en raison du manque d’accessibilité. Par conséquent, nous fournissons un protocole détaillé pour une approche benchtop à fus bbb ouverture comme point de départ pour les laboratoires intéressés à établir cette technique.
Ces études ont été menées soit avec un transducteur ultrasonique spécifique fus à air de haute puissance ou un transducteur d’immersion ultrasonique focalisée à faible puissance. Les transducteurs étaient entraînés par un amplificateur de puissance RF conçu pour les charges réactives et un générateur de fonction standard. Les détails de ces articles peuvent être trouvés dans le tableau des matériaux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici nous avons décrit une approche de benchtop au microbubble a aidé FUS BBB ouverture avec des approches alternatives comprenant, deux transducteurs différents et méthodes pour le ciblage intracrânal avec et sans guidage de MRI. Actuellement, afin d’établir l’ouverture fus BBB guidée par IRM dans le laboratoire, il ya la possibilité d’acheter d’excellents appareils prêts à l’emploi qui fournissent des résultats hautement standardisés et reproductibles avec des interfaces conviviales. Cependant, de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été appuyée en partie par une subvention du FNSE pour l’infrastructure de recherche EPSCoR à l’Université Clemson (1632881). En outre, cette recherche a été soutenue en partie par le Civitan International Research Center, Birmingham, AL. Les auteurs reconnaissent avec gratitude l’utilisation des services et des installations de l’Université de l’Alabama à Birmingham Small Animal Imaging Shared Facility Grant [NIH P30 CA013148]. Les auteurs reconnaissent Rajiv Chopra pour son soutien et ses conseils.
Materials
| Bubble shaker | Lantheus Medical Imaging | VMIX | VIALMIX, actiation device used to activate Definity microbubbles |
| Catheter plug/ Injection cap | SAI infusion technologies | Part Number: IC | Catheter plug/ Injection cap |
| Evans blue dye | Sigma | E2129-10G | Evans blue dye |
| Function generator | Tektronix | AFG3022B | Dual channel, 250MS/s, 25MHz |
| FUS transducer, 1.1MHz | FUS Instruments | TX-110 | 1 MHz MRI-compatible spherically focused ultrasound transducer with a hydrophone |
| Heating pad for Mice and Rats | Kent Scientific | PS-03 | Heating pad- PhysioSuite for Mice and Rats |
| Infusion pump | KD Scientific | 780100 | KDS 100 Legacy Single Syringe Infusion Pump |
| Kapton tape | Gizmo Dorks | https://www.amazon.com/dp/B01N1GGKRC/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_GbR7Db56HKD91 |
Gizmo Dorks Kapton Tape (Polyimide) for 3D Printers and Printing, 8 x 8 inches, 10 Sheets per Pack |
| Low power immersion transducer, 1MHz | Olympus | V303-SU | Immersion Transducer, 1 MHz, 0.50 in. Element Diameter, Standard Case Style, Straight UHF Connector, F=0.80IN PTF |
| Magnet sets | WINOMO | https://www.amazon.com/dp/B01DJZQJBG/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_JYQ7DbM32E5QC |
WINOMO 15mm Sew In Magnetic Bag Clasps for Sewing Scrapbooking – 10 Sets |
| RF amplifier | E&I | A075 | 75W |
| Tail vein catheter | BD | 382512/ Fisher Item: NC1228513 | 24g BD Insyte Autoguard shielded IV catheters (non-winged) |
| Ultrasound contrast microbubbles | Lantheus Medical Imaging | DE4, DE16 | DEFINITY (Perflutren Lipid Microsphere) |
| Ultrasound gel | Aquasonic | https://www.amazon.com/dp/B07FPQDM4F/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_D6Q7Db3J9QP7P |
Ultrasound Gel Aquasonic 100 Transmission 1 Liter Squeeze Bottle |
| Winged infusion sets, 22ga. | Fisher Healthcare | 22-258087 | Terumo Surflo Winged Infusion Sets |
| motor controller software | N/A | N/A | custom software written in LabView for controlling the Velmex motor controller |
| runtime environment for the motor controller software | National Instruments | LabView runtime engine version 2017 or better | https://www.ni.com/en-us/support/downloads/software-products/download.labview.html |
| 3 axis Linear stage actuator (XYZ positioner) | Velmex | ||
| bolts | Velmex | MB-1 | BiSlide Bolt 1/4-20×3/4" Socket cap screw (10 pack), Qty:3 |
| motor controller | Velmex | VXM-3 | Control,3 axis programmable stepping motor control, Qty:1 |
| mounting cleats | Velmex | MC-2 | Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:6 |
| mounting cleats | Velmex | MC-2 | Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:2 |
| usb to serial converter | Velmex | VXM-USB-RS232 | USB to RS232 Serial Communication Cable 10ft, Qty:1 |
| x-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| x-axis stepper motor | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| y-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| y-axis stepper motor | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| z-axis damper | Velmex | D6CL-6.3F | D6CL Damper for Type 23 Double Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| z-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| z-axis stepper motor | Velmex | PK266-03B-P2 | Vexta Type 23T2, Double Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| 3D printable files | |||
| Immersion transducer mount and pointer | https://www.tinkercad.com/things/cRgTthGXSRq | ||
| Stereotaxic frame | https://www.tinkercad.com/things/ilynoQcdqlH | ||
| Stereotaxic frame holder | https://www.tinkercad.com/things/aZNgqhBOHAX | ||
| 9.4T small bore animal MRI | Bruker | Bruker BioSpec 94/20 | ParaVision version 5.1 |
| AAV9-hsyn-GFP | Addgene | ||
| Cream hair remover | Church & Dwight | Nair cream | |
| gadobutrol MRI contrast agent | Bayer | Gadavist (Gadobutrol, 1mM/mL) | |
| Stereotactic frame | Stoelting | #51500 | not MRI compatible |
| turnkey FUS delivery device | FUS Instruments | RK-300 | ready to use MRI compatible FUS for rodents |
References
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