Transporte Axonal de Organelas em Culturas de Neurônios Motores usando sistema de câmaras microfluidas
Summary
O transporte axonal é um mecanismo crucial para a saúde dos neurônios motores. Neste protocolo fornecemos um método detalhado para rastrear o transporte axonal de compartimentos ácidos e mitocôndrias em axônios de neurônios motores usando câmaras microfluidas.
Abstract
Neurônios motores (MNs) são células altamente polarizadas com axônios muito longos. O transporte axonal é um mecanismo crucial para a saúde da MN, contribuindo para o crescimento neuronal, desenvolvimento e sobrevivência. Descrevemos um método detalhado para o uso de câmaras microfluidas (MFCs) para o rastreamento do transporte axonal de organelas fluorescentemente rotuladas em axônios MN. Este método é rápido, relativamente barato, e permite o monitoramento de pistas intracelulares no espaço e no tempo. Descrevemos um protocolo passo a passo para: 1) Fabricação de MFCs polidimetilsiloxano (PDMS); 2) Revestimento de explantas medulares ventral e cultura dissociada de MN em MFCs; 3) Rotulagem de mitocôndrias e compartimentos ácidos seguidos de imaginação confocal viva; 4) Análise manual e semiautomatizada do transporte axonal. Por último, demonstramos uma diferença no transporte de mitocôndrias e compartimentos ácidos da medula espinhal bcólmila HB9::GFP da medula espinhal explante axôns como prova da validade do sistema. Ao todo, este protocolo fornece uma ferramenta eficiente para estudar o transporte axonal de vários componentes axonais, bem como um manual simplificado para o uso de MFC para ajudar a descobrir possibilidades experimentais espaciais.
Introduction
As Esms são células altamente polarizadas com axônios longos, alcançando até um metro de comprimento em humanos adultos. Esse fenômeno cria um desafio crítico para a manutenção da conectividade e função MN. Consequentemente, as MNs dependem do transporte adequado de informações, organelas e materiais ao longo dos axônios do corpo celular para a sinapse e para trás. Vários componentes celulares, como proteínas, RNA e organelas são transportados regularmente através dos axônses. Mitocôndrias são organelas importantes que são rotineiramente transportadas em MNs. Mitocôndrias são essenciais para a atividade e função adequada das Ems, responsáveis pelo fornecimento de ATP, tampão de cálcio e processos de sinalização1,2. O transporte axonal das mitocôndrias é um processo bem estudado3,4. Curiosamente, foram relatados defeitos no transporte mitocondrial envolvidos em diversas doenças neurodegenerativas e especificamente em doenças de MN5. Compartimentos ácidos servem como outro exemplo para organelas intrínsecas que se movem ao longo de axônios MN. Compartimentos ácidos incluem lisôsôssomos, endóssomos, aparelhos trans-Golgi e certas vesículas secretas6. Defeitos no transporte axonal de compartimentos ácidos foram encontrados em diversas doenças neurodegenerativastambém 7, e artigos recentes destacam sua importância nas doenças de MN8.
Para estudar com eficiência o transporte axonal, são utilizadas câmaras microfluidas que separam compartimentos somáticos e axonais9,,10. As duas vantagens significativas do sistema microfluido, e a compartimentação e o isolamento dos axônios, tornam-no ideal para o estudo dos processos subcelulares11. A separação espacial entre os corpos das células neuronais e os axôonos pode ser usada para manipular os ambientes extracelulares de diferentes compartimentos neuronais (por exemplo, axôns vs. soma). Ensaios bioquímicos, de crescimento/degeneração neuronais e imunofluorescência todos se beneficiam desta plataforma. Os MFCs também podem auxiliar no estudo da comunicação celular-célula, codificando neurônios com outros tipos de células, como músculos esqueléticos12,,13,14.
Aqui, descrevemos um protocolo simples, mas preciso, para monitorar mitocôndrias e o transporte de compartimentos ácidos em neurônios motores. Mostramos ainda o uso deste método comparando a porcentagem relativa de organelas móveis retrógradas e anterogradas, bem como a distribuição da velocidade de transporte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, descrevemos um sistema para rastrear o transporte axonal de mitocôndrias e compartimentos ácidos nos neurônios motores. Esta plataforma in vitro simplificada permite o controle, o monitoramento e a manipulação precisas de compartimentos neuronais subcelulares, permitindo a análise experimental das funções locais dos neurônios motores. Este protocolo pode ser útil para o estudo de doenças de MN, como a ELA, para focar na compreensão do mecanismo subjacente da disfunção do transporte axonal n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação Israel science (ISF, 561/11) e do Conselho Europeu de Pesquisa (ERC, 309377).
Materials
| 35mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD35-100 | |
| 50mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD5040-100 | |
| Andor iXon DU-897 EMCCD camera | Andor | ||
| ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside) | Sigma-Aldrich | C1768 | stock of 2mM in filtered DDW |
| B-27 Supplement (50X) | Thermo Fisher | 17504044 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Biopsy punch 1.25mm | World Precision Instruments WPI | 504530 | For preperation of large MFC |
| Biopsy punch 6mm | World Precision Instruments WPI | 504533 | For preperation of small MFC |
| Biopsy punch 7mm | World Precision Instruments WPI | 504534 | For preperation of large MFC |
| Bitplane Imaris software – version 8.4.1 | Imaris | ||
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | #A3311-100G | 5% w/v in ddw |
| Chlorotrimetylsilane | Sigma-Aldrich | #386529-100ML | |
| CNTF | Alomone Labs | C-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Density Gradient Medium – Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN-25 | stock 10mg/mL in neurobasal |
| Dow Corning High-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | For epoxy mold preperation |
| DPBS 10X | Thermo Fisher | #14200-067 | dilute 1:10 in ddw |
| Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm | F.S.T | 1125520 | |
| Epoxy Hardener | Trias Chem S.R.L | IPE 743 | For epoxy mold preperation |
| Epoxy Resin | Trias Chem S.R.L | RP 026UV | For epoxy mold preperation |
| FIJI software | ImageJ | ||
| GDNF | Alomone Labs | G-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Glutamax 100X | Thermo Fisher | #35050-038 | |
| HB9:GFP mice strain | Jackson Laboratories | 005029 | |
| HBSS 10X | Thermo Fisher | #14185-045 | Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter |
| iQ software | Andor | ||
| Iris scissors, curved, 10 cm | AS Medizintechnik | 11-441-10 | |
| Iris scissors, straight, 9 cm | AS Medizintechnik | 11-440-09 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | #L-2020 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| LysoTracker Red | Thermo Fisher | L7528 | |
| Mitotracker Deep-Red FM | Thermo Fisher | M22426 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Nikon Eclipse Ti micorscope | Nikon | ||
| Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution | Biological Industries | 03-031-1 | |
| Poly-L-Ornithin (PLO) | Sigma-Aldrich | #P8638 | Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Corning Corporation | #3097358-1004 | |
| Trypsin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | T1426 | stock 25 mg/mL in 1XPBS |
| Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade | F.S.T | 15000-00 | |
| Yokogawa CSU X-1 | Yokogawa |
References
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