הובלה אקונלית של אורגלות בתרביות תאי עצב מוטוריים באמצעות מערכת צ'יימברס מיקרופלואידיג
Summary
הובלה axonal היא מנגנון מכריע. לבריאות תא העצב המוטורי בפרוטוקול זה אנו מספקים שיטה מפורטת למעקב אחר התחבורה סיבי של תאים חומצי והמיטו, בתאי עצב מוטוריים באמצעות מיקרופלואידיג צ’יימברס.
Abstract
מוטוריים נוירונים (MNs) הם תאים מקוטב מאוד עם axons ארוכים מאוד. הובלה axonal היא מנגנון מכריע עבור בריאות MN, לתרום צמיחה עצבית, פיתוח, והישרדות. אנו מתארים שיטה מפורטת לשימוש בתאי מיקרו-פלואידים (mfcs) למעקב אחר העברת אקונאליות של אורגלים בעלי תווית של מוצרים בעלי מחשב בצורת סיבי MN. שיטה זו היא מהירה, זולה יחסית, ומאפשרת ניטור של רמזים תאיים בחלל ובזמן. אנו מתארים צעד אחר צעד פרוטוקול עבור: 1) ייצור של polydiמתיל siloxane (PDMS) MFCs; 2) ציפוי של הרחבות בחוט השדרה והתרבות המונתק של MN ב-MFCs; 3) הוספת תוויות לתאי המיטומטר וחומציים בעקבות הדמיון הישיר; 4) ניתוח הובלה באופן ידני וחצי אוטומטי. לבסוף, אנו להפגין הבדל בהובלה של תאים חומציים וחומצי של HB9:: gfp ובעל חוט השדרה לחקור אקסונים כהוכחה של תוקף המערכת. לגמרי, פרוטוקול זה מספק כלי יעיל ללימוד התחבורה סיבי של רכיבי סיבי שונים, כמו גם מדריך פשוט עבור שימוש MFC כדי לעזור לגלות אפשרויות ניסיוני מרחבי.
Introduction
MNs הם תאים מקוטנים מאוד עם axons ארוכים, מגיע עד מטר אחד באורך של בני אדם למבוגרים. תופעה זו יוצרת אתגר קריטי לשמירה על קישוריות ותפקוד של MN. כתוצאה מכך, MNs תלויה בהובלה תקינה של מידע, אורגלים וחומרים לאורך האקסונים מהגוף הסלולארי שלהם אל הסינפסה וחזרה. רכיבים סלולאריים שונים, כגון חלבונים, RNA ואורגלים, מדילג באופן סדיר דרך האקסונים. מיטוכונמיטויום הם אורגלים חשובים אשר מועברים באופן שגרתי ב-MNs. מיטוגרם הם חיוניים לפעילות תקינה ולתפקוד של MNs, האחראי על הוראת ATP, אגירת סידן ותהליכי איתות1,2. התחבורה האקונלית של המיטו, היא תהליך לומד היטב3,4. מעניין, פגמים בתחבורה מיטוכונדריאלי דווחו להיות מעורבים במספר מחלות ניווניות ובמיוחד במחלות MN5. התאים החומציים משמשים כדוגמה נוספת לאורגלים פנימיים הזזים לאורך MN axons. תאי חומציים כוללים ליזוזומים, אנזומים, מכשירי טרנס-גולג’י ושלפוחיות מסוימות. פגמים בתחבורה סיבי של תאים חומציים נמצאו במספר מחלות ניווניות כמו גם7, העיתונים האחרונים להדגיש את חשיבותם במחלות MN8.
כדי לחקור ביעילות את התחבורה סיבי, מיקרופלואידיג צ’יימברס המפרידים בין התאים הסומונטיים והאקאליות משמשים לעתים קרובות9,10. שני היתרונות המשמעותיים של מערכת המיקרופלואידיג, והתקשורת והבידוד של האקסונים, מעבדים אותו באופן אידיאלי ללימוד תהליכים תת-תאיים11. ניתן להשתמש בהפרדה המרחבית בין גופי התאים העצביים לבין האקסונים כדי לתמרן את סביבות החילוץ של התאים העצביים השונים (לדוגמה, אקסונים vs. סומה). , והתנוונות שהכל מהווה תועלת. מפלטפורמה זו Mfcs יכול גם לסייע ללמוד תקשורת תא לתאים על ידי הנוירונים coculturing עם סוגי תאים אחרים, כגון שרירי השלד12,13,14.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט אך מדויק עבור ניטור המיטו, התחבורה תא חומצי בתוך נוירונים מוטוריים. אנו מציגים את השימוש בשיטה זו על-ידי השוואת האחוז היחסי של מארגני נסיגה וכיתות מעבר, כמו גם הפצת מהירות התחבורה.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול זה, אנו מתארים מערכת כדי לעקוב אחר התחבורה סיבי של תאי המיטויונים ו חומצי ב נוירונים מוטוריים. זה פשוט בפלטפורמת מבחנה מאפשר שליטה מדויקת, ניטור, ומניפולציה של תאים עצביים תת-תאית, המאפשר ניתוח ניסיוני של התפקוד המקומי בתאי עצב. פרוטוקול זה יכול להועיל ללימוד מחלות MN כגון ALS, כדי ל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מקרן המדע הישראלית (קרן, 561/11) ומועצת המחקר האירופית (ERC, 309377).
Materials
| 35mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD35-100 | |
| 50mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD5040-100 | |
| Andor iXon DU-897 EMCCD camera | Andor | ||
| ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside) | Sigma-Aldrich | C1768 | stock of 2mM in filtered DDW |
| B-27 Supplement (50X) | Thermo Fisher | 17504044 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Biopsy punch 1.25mm | World Precision Instruments WPI | 504530 | For preperation of large MFC |
| Biopsy punch 6mm | World Precision Instruments WPI | 504533 | For preperation of small MFC |
| Biopsy punch 7mm | World Precision Instruments WPI | 504534 | For preperation of large MFC |
| Bitplane Imaris software – version 8.4.1 | Imaris | ||
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | #A3311-100G | 5% w/v in ddw |
| Chlorotrimetylsilane | Sigma-Aldrich | #386529-100ML | |
| CNTF | Alomone Labs | C-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Density Gradient Medium – Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN-25 | stock 10mg/mL in neurobasal |
| Dow Corning High-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | For epoxy mold preperation |
| DPBS 10X | Thermo Fisher | #14200-067 | dilute 1:10 in ddw |
| Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm | F.S.T | 1125520 | |
| Epoxy Hardener | Trias Chem S.R.L | IPE 743 | For epoxy mold preperation |
| Epoxy Resin | Trias Chem S.R.L | RP 026UV | For epoxy mold preperation |
| FIJI software | ImageJ | ||
| GDNF | Alomone Labs | G-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Glutamax 100X | Thermo Fisher | #35050-038 | |
| HB9:GFP mice strain | Jackson Laboratories | 005029 | |
| HBSS 10X | Thermo Fisher | #14185-045 | Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter |
| iQ software | Andor | ||
| Iris scissors, curved, 10 cm | AS Medizintechnik | 11-441-10 | |
| Iris scissors, straight, 9 cm | AS Medizintechnik | 11-440-09 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | #L-2020 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| LysoTracker Red | Thermo Fisher | L7528 | |
| Mitotracker Deep-Red FM | Thermo Fisher | M22426 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Nikon Eclipse Ti micorscope | Nikon | ||
| Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution | Biological Industries | 03-031-1 | |
| Poly-L-Ornithin (PLO) | Sigma-Aldrich | #P8638 | Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Corning Corporation | #3097358-1004 | |
| Trypsin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | T1426 | stock 25 mg/mL in 1XPBS |
| Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade | F.S.T | 15000-00 | |
| Yokogawa CSU X-1 | Yokogawa |
References
- Misgeld, T., Schwarz, T. L. Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture. Neuron. 96, 651-666 (2017).
- Devine, M. J., Kittler, J. T. Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease. Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).
- Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
- Mandal, A., Drerup, C. M. Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373 (2019).
- Magrané, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).
- Anderson, R. G. W., Orci, L. A view of acidic intracellular compartments. Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).
- Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration. Current Biology. 28, R471-R486 (2018).
- Ya-Cheng Liao, A., et al. RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether. Cell. 179, 147-164 (2019).
- Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers. Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).
- Gershoni-Emek, N., et al. Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311 (2018).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance. European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).
- Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
- Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ. Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).
- Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).
- Ionescu, A., et al. Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model. Cell Death & Disease. 10 (3), 210 (2019).
- Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
- Maimon, R., et al. Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS. Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).
