نموذج مناعي لزرع خلايا القلب الهيترولوجي وخلايا عضلة القلب في الفئران
Summary
نحن نصف نموذجًا لزراعة قلب البطن غير المعوثي في الفئران ، مما يعني تعديلات على الاستراتيجيات الحالية ، مما يؤدي إلى نهج جراحي مبسط. بالإضافة إلى ذلك، نحن نصف نموذج الرفض الجديد عن طريق الحقن داخل الأذن لخلايا عضلة القلب الحيوية، مما يسمح بإجراء المزيد من التحليلات المناعية لعملية زرع في الفئران.
Abstract
كانت زراعة القلب الهيتروبية في الفئران نموذجًا شائعالاستخدام للدراسات المناعية المتنوعة لأكثر من 50 عامًا. وقد أُبلغ عن عدة تعديلات منذ الوصف الأول في عام 1964. بعد 30 عامًا من إجراء زراعة القلب الغيرية في الفئران ، طورنا نهجًا جراحيًا مبسطًا ، والذي يمكن تعليمه وإجراؤه بسهولة دون مزيد من التدريب الجراحي أو الخلفية.
After dissection of the ascending aorta and the pulmonary artery and ligation of superior and inferior caval and pulmonary veins, the donor heart is harvested and subsequently perfused with ice-cold saline solution supplemented with heparin. بعد لقط وتقنين الأوعية البطن المتلقية، المتبرع يصعد الشريان الأورطا والشريان الرئوي هي anastomosed إلى الشريان الأورطا البطن المتلقي والوريد الوريد افينا السفلي، على التوالي، وذلك باستخدام غرز الجري المستمر.
اعتمادا على مجموعات مختلفة بين المانحين والمتلقي، يسمح هذا النموذج بتحليل الرفض الحاد أو المزمن للالوجرافات. ومما يعزز الأهمية المناعية لهذا النموذج من خلال نهج جديد من حقن داخل الأذن من خلايا عضلة القلب الحيوية والتحليل اللاحق لاستنزاف الأنسجة اللمفاوية عنق الرحم.
Introduction
زرع القلب الهيتروتوبي هو نموذج تجريبي يستخدم بشكل متكرر للتحقيقات المختلفة المتعلقة بتحمل زراعة الأعضاء ، ورفض allograft الحاد والمزمن ، وإصابة نقص التروية وإعادة التروية ، وتضخم الآلة أو إعادة عرض القلب. من بين مزايا أخرى ، يمكن مراقبة وظيفة الكسب غير المشروع بشكل غير جراحي عن طريق الجس والفشل في الكسب غير المشروع لا يؤدي إلى ضعف حيوي للمتلقي على النقيض من الأعضاء الأخرى ، مثل الكلى أو الكبد.
في عام 1964، وصف أبوت وآخرون في البداية زرع قلب البطن التغايري في الفئران1. في وقت لاحق، في عام 1966، وصفت تقنية من طرف إلى طرف لanastomoses من قبل توميتا وآخرون2. تم الإبلاغ عن الأساس للنموذج المستخدم حاليا من قبل اونو وليندسي في عام 19693. خلال العقود الماضية، تم نشر العديد من التعديلات لإنشاء أنواع مختلفة من الطعوم القلب البطيني تفريغ، محملة جزئيا أو محملة بما في ذلك الجمع بين غير النوبة زرع القلب والرئة4،5،6. بالنسبة للتحليلات المناعية، يتم إجراء زراعة ترقيع القلب غير المحملة بالحجم الأكثر شيوعًا. في هذه الحالة، تدفق الدم يدخل إلى الوراء الشريان الأورطا الصاعد المانحة وبالتالي الشرايين التاجية. يحدث الصرف الوريدي على طول الجيوب الأنفية التاجية في الأذين الأيمن والبطين(الشكل 1A-B). لذلك ، يتم استبعاد البطين الأيسر من تدفق الدم ، بصرف النظر عن الكميات الهامشية من الدم من الأوردة البسية. وهذا أيضا يجعل من نموذج مفيد لدراسة الآليات الفيزيولوجية المرضية خلال البطين الأيسر مساعدة الجهاز العلاج7.
وقد أجريت زراعة القلب الهيتروبية في أنواع مختلفة بما في ذلك الفئران والأرانب والخنازير وحتى تم استخدامها كجهاز مساعدة أحادي أو ثنائي في البشر8,9,10,11. لا يزال الجرذ يمثل الحيوان التجريبي الشعبي لنماذج زراعة الأعضاء ، خاصة وأن أوقات البقاء على قيد الحياة للكسب غير المشروع لتركيبات سلالات الفئران المختلفة كانت محددة بشكل جيد في الماضي وعدد كبير من الكواشف المناعية يمكن الوصول إليها12،13. على عكس الفئران ، الفئران هي أكبر مما يجعل الجراحة والوصول إلى الأنسجة اللمفاوية للتحليلات المناعية أكثر جدوى12. وعلاوة على ذلك، فإن إدخال تكنولوجيات الاستنساخ التجاري في الفئران في السنوات الأخيرة سيؤدي على الأرجح إلى الاهتمام المتكرر بنماذج الفئران التجريبية14.
بشكل عام ، يمكن توصيل طعوم القلب الغيرية بالأوعية المتلقية إما عن طريق إجراء انستوموز عنق الرحم أو البطن. ومع ذلك، تشير بعض الدراسات إلى أن الأناستوموسيس الفخذي يسهل تحسين الرصد بسبب الوصول الأفضل للملامسة اليدوية أو تخطيط صدى القلب وإعادة النظر في الصدى، وبالتالي يسمح بالكشف بشكل أكثر دقة عن فشل الكسب غير المشروع15،16.
وقد ثبت أنه لا يوجد فرق فيما يتعلق بوقت العملية ومعدل المضاعفات والنتيجة ووقت البقاء على قيد الحياة الكسب غير المشروع بين كل من تقنيات anastomosis17. ومن الواضح أن توافر عدد كاف من الغدد الليمفاوية المستنزفة يجب أن يذكر كفائدة من الانسطوموسات العنقية. ومع ذلك، هناك حاجة إلى فترات تدريب أطول. في المقابل ، فإن أنسح البطن أقل تعقيدًا وقيمة بنفس القدر للتحقيقات المناعية ، خاصة عندما يقترن بنتائج طريقة جديدة لحقن خلايا عضلة القلب المتعددة الألياف واستئصال الغدد الليمفاوية اللاحقة في عنق الرحم. مزيج من كلا النموذجين يقدم مجموعة واسعة من التحليلات المناعية بعد التدخل.
البروتوكول التالي يشير إلى التشغيل في أزواج من الجراحين من أجل تقليل وقت نقص التروية. ومع ذلك، يمكن إجراء جميع التجارب من قبل شخص واحد. يتم عرض إعداد الأدوات والمواد لزراعة القلب وزرع في الشكل 2A-B.
Protocol
Representative Results
Discussion
تعتمد الطريقة الموصوفة سابقًا لزراعة القلب الغيرتوب في الفئران بشكل رئيسي على وصف Ono و Lindsey في عام 19693. ومنذ ذلك الحين، أدخلت عدة تعديلات على أنواع مختلفة مما أدى إلى تنوع واسع في هذا النموذج. الجمع بين العديد من هذه التعديلات وإدخال تجربتنا الخاصة الناتجة عن أكثر من 30 عاما من إ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نريد أن نشكر بريتا تراوتفيغ وكورينا لوببرت وإنغريد ميدر على التزامهم.
Materials
| Anesthesia device (including isoflurane vaporizer) | Summit Anesthesia Solutions | No Catalog Number available | |
| Cannula (27 G) | BD Microlance | 302200 | |
| Carprofen | Pfizer | Rimadyl 50 mg/mL | |
| Cellstar Tubes (15 mL) | GreinerBioOne | 188271 | |
| Cell strainer (40 µm) | BD Falcon | 2271680 | |
| Collagenase Type CLSII | Biochrome | C2-22 | |
| Compresses 5×5 cm | Fuhrmann | 31501 | |
| Compresses 7.5×7.5 cm | Fuhrmann | 31505 | |
| Cotton swabs | Heinz Herenz Medizinalbedarf | 1032128 | |
| Dexpathenol (5 %) | Bayer | "Bepanthen" | |
| DPBS BioWhittaker | Lonza | 17-512F | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD557R | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD313R | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD35 | |
| Heating mat | Gaymar Industries | "T/Pump" | |
| Hemostatic gauze | Ethicon | Tabotamp | |
| Heparin-Natrium 25 000 I.E. | Ratiopharm | No Catalog Number available | |
| Isofluran CP | CP-Pharma | No Catalog Number available | |
| Large-pored sieve (stainless steel) | Forschungswerkstätten Hannover Medical School | No Catalog Number available | |
| Lidocaine | Astra Zeneca | 2 % Xylocain | |
| Metamizol-Natrium | Ratiopharma | Novaminsulfon 500 mg/mL | |
| Micro forceps | B. Braun | Aesculap BD3361 | |
| Micro needle holder | Codman, Johnson & Johnson Medical | Codmann 80-2003 | |
| Micro needle holder | B. Braun | Aesculap BD336R | |
| Micro needle holder | B. Braun | Aesculap FD241R | |
| Micro scissors | B. Braun | Aesculap FD101R | |
| Micro scissors | B. Braun | Aesculap FM471R | |
| Needle holder | B. Braun | Aesculap BM221R | |
| Penicillin/Streptomycin/Glutamine (100x) | PAA | P11-010 | |
| Peripheral venous catheter (18 G) | B. Braun | 4268334B | |
| Peripheral venous catheter (22 G) | B. Braun | 4268091B | |
| Probe pointed scissors | B. Braun | Aesculap BC030R | |
| Retractors | Forschungswerkstätten Hannover Medical School | No Catalog Number available | |
| RPMI culture medium | Lonza | BE12-702F | |
| Saline solution (NaCl 0.9 %) | Baxter | No Catalog Number available | |
| Scissors | B. Braun | Aesculap BC414 | |
| Surgical microscope | Carl-Zeiss | OPMI-MDM | |
| Sutures (anastomoses) | Catgut | Mariderm 8-0 monofil | |
| Sutures (ligature) | Resorba | Silk 5-0 polyfil | |
| Sutures (skin, fascia) | Ethicon | Mersilene 3-0 | |
| Syringe (1 mL) | B. Braun | 9166017V | |
| Syringe (10 mL) | B. Braun | 4606108V | |
| Syringe (20 mL) | B. Braun | 4606205V | |
| Vascular clamp | B. Braun | Aesculap FB708R |
References
- Abbott, C. P., et al. A Technique for Heart Transplantation In the Rat. Archives of Surgery. 89 (4), 645-652 (1964).
- Tomita, F. Heart homotransplantation in the rat. Sapporo igaku zasshi. The Sapporo Medical Journal. 30 (4), 165-183 (1966).
- Ono, K., Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 57 (2), 225-229 (1969).
- Wen, P., et al. A simple technique for a new working heterotopic heart transplantation model in rats. Transplantation Proceedings. 45 (6), 2522-2526 (2013).
- Benke, K., et al. Heterotopic abdominal rat heart transplantation as a model to investigate volume dependency of myocardial remodeling. Transplantation. 101 (3), 498-505 (2017).
- Kearns, M. J., et al. Rat Heterotopic Abdominal Heart/Single-lung Transplantation in a Volume-loaded Configuration. Journal of Visualized Experiments. (99), 52418 (2015).
- Ibrahim, M., et al. Heterotopic abdominal heart transplantation in rats for functional studies of ventricular unloading. The Journal of Surgical Research. 179 (1), e31-e39 (2013).
- Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. Journal of Visualized Experiments. (6), 238 (2007).
- Lu, W., et al. A new simplified volume-loaded heterotopic rabbit heart transplant model with improved techniques and a standard operating procedure. Journal of Thoracic Disease. 7 (4), 653-661 (2015).
- Kitahara, H., et al. Heterotopic transplantation of a decellularized and recellularized whole porcine heart. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 22 (5), 571-579 (2016).
- Kadner, A., et al. Heterotopic heart transplantation: experimental development and clinical experience. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 17 (4), 474-481 (2000).
- Zinöcker, S., et al. Immune reconstitution and graft-versus-host reactions in rat models of allogeneic hematopoietic cell transplantation. Frontiers in Immunology. 3 (NOV), 1-12 (2012).
- Klempnauer, J., et al. Genetic control of rat heart allograft rejection: effect of different MHC and non-MHC incompatibilities. Immunogenetics. 30, 81-88 (1989).
- Huang, G., et al. Genetic manipulations in the rat: Progress and prospects. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (4), 391-399 (2011).
- Gordon, C. R., et al. Pulse doppler and M-mode to assess viability of cardiac allografts using heterotopic femoral heart transplantation in rats. Microsurgery. 27 (4), 240-244 (2007).
- Gordon, C. R., et al. A new modified technique for heterotopic femoral heart transplantation in rats. The Journal of Surgical Research. 139 (2), 157-163 (2007).
- Ma, Y., Wang, G. Comparison of 2 heterotopic heart transplant techniques in rats: cervical and abdominal heart. Experimental and Clinical Transplantation. 9 (2), 128-133 (2011).
- Bektas, H., et al. Differential effect of donor-specific blood transfusions after kidney, heart, pancreas, and skin transplantation in major histocompatibility complex-incompatible rats. Transfusion. 37 (2), 226-230 (1997).
- Saiho, K. O., et al. Long-term allograft acceptance induced by single dose anti-leukocyte common antigen (RT7) antibody in the rat. Transplantation. 71 (8), 1124-1131 (2001).
- Bektas, H., et al. Blood transfers infectious immunologic tolerance in MHC-incompatible heart transplantation in rats. Journal of Heart and Lung Transplantation. 24 (5), 614-617 (2005).
- Jäger, M. D., et al. Sirolimus promotes tolerance for donor and recipient antigens after MHC class II disparate bone marrow transplantation in rats. Experimental Hematology. 35 (1), 164-170 (2007).
- Timrott, K., et al. Application of allogeneic bone marrow cells in view of residual alloreactivity: Sirolimus but not cyclosporine evolves tolerogenic properties. PLoS ONE. 10 (4), 1-16 (2015).
- Hadamitzky, M., et al. Memory-updating abrogates extinction of learned immunosuppression. Brain, Behavior, and Immunity. 52, 40-48 (2016).
- Beetz, O., et al. Recipient natural killer cells alter the course of rejection of allogeneic heart grafts in rats. Plos One. 14 (8), e0220546 (2019).
- Hirschburger, M., et al. Nicotine Attenuates Macrophage Infiltration in Rat Lung Allografts. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 28 (5), 493-500 (2009).
- Ruzza, A., et al. Heterotopic heart transplantation in rats: improved anesthetic and surgical technique. Transplantation Proceedings. 42 (9), 3828-3832 (2010).
- Wang, D., et al. A simplified technique for heart transplantation in rats: abdominal vessel branch-sparing and modified venotomy. Microsurgery. 26 (6), 470-472 (2006).
- Wang, C., et al. A modified method for heterotopic mouse heart transplantion. Journal of Visualized Experiments. (88), (2014).
- Al-Amran, F. G., Shahkolahi, M. M. Total arterial anastomosis heterotopic heart transplantation model. Transplantation Proceedings. 45 (2), 625-629 (2013).
- Hoerstrup, S. P., et al. Modified technique for heterotopic rat heart transplantation under cardioplegic arrest. Journal of Investigative Surgery. 13 (2), 73-77 (2000).
- Fry, D. L. Acute vascular endothelial changes associated with increased blood velocity gradients. Circulation Research. 22 (2), 165-197 (1968).
- Ahmadi, A. R., et al. Orthotopic Rat Kidney Transplantation: A Novel and Simplified Surgical Approach. Journal of Visualized Experiments. (147), (2019).
- Schmid, C., et al. Successful heterotopic heart transplantation in rat. Microsurgery. 15 (4), 279-281 (1994).
- Shan, J., et al. A modified technique for heterotopic heart transplantation in rats. Journal of Surgical Research. 164 (1), 155-161 (2010).
- Moris, D., et al. Mechanisms of liver-induced tolerance. Current Opinion in Organ Transplantation. 22 (1), 71-78 (2017).
- Bickerstaff, A. A., et al. Murine renal allografts: spontaneous acceptance is associated with regulated T cell-mediated immunity. Journal of Immunology. 167 (9), 4821-4827 (2001).
- Mottram, P. L., et al. Electrocardiographic monitoring of cardiac transplants in mice. Cardiovascular Research. 22 (5), 315-321 (1988).
- Torre-Amione, G., et al. Decreased expression of tumor necrosis factor-α in failing human myocardium after mechanical circulatory support: A potential mechanism for cardiac recovery. Circulation. 100 (11), 1189-1193 (1999).
- Goldstein, D. J., et al. Circulatory resuscitation with left ventricular assist device support reduces interleukins 6 and 8 levels. The Annals of Thoracic Surgery. 63 (4), 971-974 (1997).
- Tang-Quan, K. R., et al. Non-volume-loaded heart provides a more relevant heterotopic transplantation model. Transplant Immunology. 23 (1-2), 65-70 (2010).
- Lakhal-Naouar, I., et al. Transcutaneous immunization using SLA or rLACK skews the immune response towards a Th1 profile but fails to protect BALB/c mice against a Leishmania major challenge. Vaccine. 37 (3), 516-523 (2019).
- Sousa-Batista, A. J., et al. Novel and safe single-dose treatment of cutaneous leishmaniasis with implantable amphotericin B-loaded microparticles. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. , (2019).
