Summary

Um modelo imunológico para transplante heterotópico de células cardíacas e cardíacas em ratos

Published: May 08, 2020
doi:

Summary

Descrevemos um modelo de transplante de coração abdominal heterotópico em ratos, implicando modificações nas estratégias atuais, que levam a uma abordagem cirúrgica simplificada. Além disso, descrevemos um novo modelo de rejeição pela injeção in-ear de células musculares cardíacas vitais, permitindo novas análises imunológicas de transplante em ratos.

Abstract

O transplante de coração heterotópico em ratos tem sido um modelo comumente utilizado para diversos estudos imunológicos há mais de 50 anos. Várias modificações foram relatadas desde a primeira descrição em 1964. Após 30 anos realizando transplante de coração heterotópico em ratos, desenvolvemos uma abordagem cirúrgica simplificada, que pode ser facilmente ensinada e realizada sem maior treinamento cirúrgico ou antecedentes.

Após a dissecção da aorta ascendente e da artéria pulmonar e da ligadura de veias superiores e inferiores caval e pulmonar, o coração do doador é colhido e posteriormente perfundido com solução salina gelada suplementada com heparina. Após a fixação e incisamento dos vasos abdominais receptores, o doador ascendente de aorta e artéria pulmonar são anastomosados para a aorta abdominal receptora e veia cava inferior, respectivamente, usando suturas contínuas de corrida.

Dependendo de diferentes combinações doador-receptor, este modelo permite análises de rejeição aguda ou crônica de aloenxertos. O significado imunológico deste modelo é ainda mais aprimorado por uma nova abordagem da injeção intra-auricular de células musculares cardíacas vitais e posterior análise do tecido linfático cervical drenante.

Introduction

O transplante de coração heterotópico é um modelo experimental frequentemente utilizado para diferentes investigações sobre tolerância ao transplante, rejeição aguda e crônica de aloenxerto, lesão isquemia-reperfusão, perfusão de máquinas ou remodelagem cardíaca. Entre outras vantagens, a função do enxerto pode ser monitorada de forma não invasiva por palpação e a falha do enxerto não leva a um prejuízo vital do receptor em contraste com outros órgãos, como rins ou fígados.

Em 1964, Abbott et al. descreveram inicialmente transplante de coração abdominal heterotópico em ratos1. Mais tarde, em 1966, a técnica de ponta a ponta para anastomoses foi descrita por Tomita et al.2. As bases para o modelo atualmente usado foram relatadas por Ono e Lindsey em 19693. Durante as últimas décadas, várias modificações foram publicadas para criar diferentes tipos de enxertos cardíacos ventriculares esquerdos descarregados, parcialmente carregados ou carregados, incluindo transplante heterotópico heterotópico coração-pulmão4,5,6. Para análises imunológicas, é mais comumente realizado um transplante de enxerto cardíaco carregado sem volume. Neste caso, o fluxo sanguíneo entra retrógradamente na aorta ascendente do doador e, posteriormente, nas artérias coronárias. A drenagem venosa ocorre ao longo do seio coronário no átrio direito e ventrículo(Figura 1A-B). Portanto, o ventrículo esquerdo está excluído do fluxo sanguíneo, além de quantidades marginais de sangue das veias tesésias. Isso também o torna um modelo útil para o estudo dos mecanismos fisiopatológicos durante a terapia do dispositivo de assistência ventricular esquerda7.

O transplante de coração heterotópico tem sido realizado em várias espécies, incluindo camundongos, coelhos, porcos e tem sido até usado como um dispositivo de assistência uniou ou biventricular em humanos8,,9,,10,11. O rato ainda representa um animal experimental popular para modelos de transplante, especialmente porque os tempos de sobrevivência do enxerto para diferentes combinações de cepas de ratos foram bem definidos no passado e um grande número de reagentes imunológicos são acessíveis12,13. Ao contrário dos camundongos, os ratos são maiores fazendo cirurgia e acesso ao tecido linfático para análises imunológicas mais viável12. Além disso, a introdução de tecnologias comerciais de clonagem em ratos nos últimos anos provavelmente levará a um interesse recorrente em modelos experimentais de ratos14.

Em geral, enxertos cardíacos heterotópicos podem ser anexados aos vasos receptores, seja realizando anastomose cervical ou abdominal. No entanto, alguns estudos sugerem que uma anastomose femoral facilita o melhor monitoramento devido ao melhor acesso à palpação manual ou ecocardiografia transfemoral e, portanto, permite uma detecção mais precisa da falha do enxerto15,16.

Mostrou-se que não há diferença quanto ao tempo de operação, taxa de complicações, desfecho e tempo de sobrevivência do enxerto entre ambas as técnicas de anastomose17. Claramente, a disponibilidade de um número suficiente de linfonodos drenantes deve ser mencionada como um benefício da anastomose cervical; no entanto, períodos de treinamento mais longos são necessários. Em contraste, a anastomose abdominal é menos complicada e igualmente valiosa para investigações imunológicas, especialmente quando combinada com resultados de um novo método de injeção intra-auricular de células musculares cardíacas alogênicas e linfadenectomia cervical subseqüente. Uma combinação de ambos os modelos oferece um amplo espectro de análises imunológicas pós-intervencionistas.

O protocolo a seguir refere-se à operação em pares de cirurgiões, a fim de reduzir o tempo de isquemia. No entanto, todos os experimentos podem ser realizados por uma única pessoa. A configuração de instrumentos e materiais para explantação e implantação de coração é exibida na Figura 2A-B.

Protocol

Todas as experiências com animais foram realizadas de acordo com as diretrizes do Conselho de Ética Animal das autoridades regionais de defesa do consumidor e segurança alimentar da Baixa Saxônia (LAVES, Oldenburg, Alemanha) com as ids de aprovação 12/0768 e 17/2472. 1. Explantação e perfusão cardíaca NOTA: Como doadores de enxerto, foram utilizados ratos do sexo feminino ou masculino com idade de 7 a 22 semanas. Anestesie o rato doador por inala…

Representative Results

No passado, diferentes questões imunológicas foram abordadas com base no modelo, que foi validado no grupo de trabalho por mais de 500 transplantes com uma taxa de sobrevivência superior a 95,18,19,20,21,22,23,24. O te…

Discussion

O método anteriormente descrito de transplante cardíaco heterotópico em ratos baseia-se principalmente na descrição de Ono e Lindsey em 19693. Desde então, várias modificações foram introduzidas em várias espécies levando a uma ampla diversidade deste modelo. Combinando várias dessas modificações e introduzindo nossa própria experiência resultante de mais de 30 anos realizando transplantes de coração heterotópicos em laboratório, criamos uma abordagem cirúrgica viável, que n?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Queremos agradecer a Britta Trautewig, Corinna Löbbert e Ingrid Meder pelo comprometimento.

Materials

Anesthesia device (including isoflurane vaporizer) Summit Anesthesia Solutions No Catalog Number available
Cannula (27 G) BD Microlance 302200
Carprofen Pfizer Rimadyl 50 mg/mL
Cellstar Tubes (15 mL) GreinerBioOne 188271
Cell strainer (40 µm) BD Falcon 2271680
Collagenase Type CLSII Biochrome C2-22
Compresses 5×5 cm Fuhrmann 31501
Compresses 7.5×7.5 cm Fuhrmann 31505
Cotton swabs Heinz Herenz Medizinalbedarf 1032128
Dexpathenol (5 %) Bayer "Bepanthen"
DPBS BioWhittaker Lonza 17-512F
Forceps B. Braun Aesculap BD557R
Forceps B. Braun Aesculap BD313R
Forceps B. Braun Aesculap BD35
Heating mat Gaymar Industries "T/Pump"
Hemostatic gauze Ethicon Tabotamp
Heparin-Natrium 25 000 I.E. Ratiopharm No Catalog Number available
Isofluran CP CP-Pharma No Catalog Number available
Large-pored sieve (stainless steel) Forschungswerkstätten Hannover Medical School No Catalog Number available
Lidocaine Astra Zeneca 2 % Xylocain
Metamizol-Natrium Ratiopharma Novaminsulfon 500 mg/mL
Micro forceps B. Braun Aesculap BD3361
Micro needle holder Codman, Johnson & Johnson Medical Codmann 80-2003
Micro needle holder B. Braun Aesculap BD336R
Micro needle holder B. Braun Aesculap FD241R
Micro scissors B. Braun Aesculap FD101R
Micro scissors B. Braun Aesculap FM471R
Needle holder B. Braun Aesculap BM221R
Penicillin/Streptomycin/Glutamine (100x) PAA P11-010
Peripheral venous catheter (18 G) B. Braun 4268334B
Peripheral venous catheter (22 G) B. Braun 4268091B
Probe pointed scissors B. Braun Aesculap BC030R
Retractors Forschungswerkstätten Hannover Medical School No Catalog Number available
RPMI culture medium Lonza BE12-702F
Saline solution (NaCl 0.9 %) Baxter No Catalog Number available
Scissors B. Braun Aesculap BC414
Surgical microscope Carl-Zeiss OPMI-MDM
Sutures (anastomoses) Catgut Mariderm 8-0 monofil
Sutures (ligature) Resorba Silk 5-0 polyfil
Sutures (skin, fascia) Ethicon Mersilene 3-0
Syringe (1 mL) B. Braun 9166017V
Syringe (10 mL) B. Braun 4606108V
Syringe (20 mL) B. Braun 4606205V
Vascular clamp B. Braun Aesculap FB708R

References

  1. Abbott, C. P., et al. A Technique for Heart Transplantation In the Rat. Archives of Surgery. 89 (4), 645-652 (1964).
  2. Tomita, F. Heart homotransplantation in the rat. Sapporo igaku zasshi. The Sapporo Medical Journal. 30 (4), 165-183 (1966).
  3. Ono, K., Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 57 (2), 225-229 (1969).
  4. Wen, P., et al. A simple technique for a new working heterotopic heart transplantation model in rats. Transplantation Proceedings. 45 (6), 2522-2526 (2013).
  5. Benke, K., et al. Heterotopic abdominal rat heart transplantation as a model to investigate volume dependency of myocardial remodeling. Transplantation. 101 (3), 498-505 (2017).
  6. Kearns, M. J., et al. Rat Heterotopic Abdominal Heart/Single-lung Transplantation in a Volume-loaded Configuration. Journal of Visualized Experiments. (99), 52418 (2015).
  7. Ibrahim, M., et al. Heterotopic abdominal heart transplantation in rats for functional studies of ventricular unloading. The Journal of Surgical Research. 179 (1), e31-e39 (2013).
  8. Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. Journal of Visualized Experiments. (6), 238 (2007).
  9. Lu, W., et al. A new simplified volume-loaded heterotopic rabbit heart transplant model with improved techniques and a standard operating procedure. Journal of Thoracic Disease. 7 (4), 653-661 (2015).
  10. Kitahara, H., et al. Heterotopic transplantation of a decellularized and recellularized whole porcine heart. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 22 (5), 571-579 (2016).
  11. Kadner, A., et al. Heterotopic heart transplantation: experimental development and clinical experience. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 17 (4), 474-481 (2000).
  12. Zinöcker, S., et al. Immune reconstitution and graft-versus-host reactions in rat models of allogeneic hematopoietic cell transplantation. Frontiers in Immunology. 3 (NOV), 1-12 (2012).
  13. Klempnauer, J., et al. Genetic control of rat heart allograft rejection: effect of different MHC and non-MHC incompatibilities. Immunogenetics. 30, 81-88 (1989).
  14. Huang, G., et al. Genetic manipulations in the rat: Progress and prospects. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (4), 391-399 (2011).
  15. Gordon, C. R., et al. Pulse doppler and M-mode to assess viability of cardiac allografts using heterotopic femoral heart transplantation in rats. Microsurgery. 27 (4), 240-244 (2007).
  16. Gordon, C. R., et al. A new modified technique for heterotopic femoral heart transplantation in rats. The Journal of Surgical Research. 139 (2), 157-163 (2007).
  17. Ma, Y., Wang, G. Comparison of 2 heterotopic heart transplant techniques in rats: cervical and abdominal heart. Experimental and Clinical Transplantation. 9 (2), 128-133 (2011).
  18. Bektas, H., et al. Differential effect of donor-specific blood transfusions after kidney, heart, pancreas, and skin transplantation in major histocompatibility complex-incompatible rats. Transfusion. 37 (2), 226-230 (1997).
  19. Saiho, K. O., et al. Long-term allograft acceptance induced by single dose anti-leukocyte common antigen (RT7) antibody in the rat. Transplantation. 71 (8), 1124-1131 (2001).
  20. Bektas, H., et al. Blood transfers infectious immunologic tolerance in MHC-incompatible heart transplantation in rats. Journal of Heart and Lung Transplantation. 24 (5), 614-617 (2005).
  21. Jäger, M. D., et al. Sirolimus promotes tolerance for donor and recipient antigens after MHC class II disparate bone marrow transplantation in rats. Experimental Hematology. 35 (1), 164-170 (2007).
  22. Timrott, K., et al. Application of allogeneic bone marrow cells in view of residual alloreactivity: Sirolimus but not cyclosporine evolves tolerogenic properties. PLoS ONE. 10 (4), 1-16 (2015).
  23. Hadamitzky, M., et al. Memory-updating abrogates extinction of learned immunosuppression. Brain, Behavior, and Immunity. 52, 40-48 (2016).
  24. Beetz, O., et al. Recipient natural killer cells alter the course of rejection of allogeneic heart grafts in rats. Plos One. 14 (8), e0220546 (2019).
  25. Hirschburger, M., et al. Nicotine Attenuates Macrophage Infiltration in Rat Lung Allografts. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 28 (5), 493-500 (2009).
  26. Ruzza, A., et al. Heterotopic heart transplantation in rats: improved anesthetic and surgical technique. Transplantation Proceedings. 42 (9), 3828-3832 (2010).
  27. Wang, D., et al. A simplified technique for heart transplantation in rats: abdominal vessel branch-sparing and modified venotomy. Microsurgery. 26 (6), 470-472 (2006).
  28. Wang, C., et al. A modified method for heterotopic mouse heart transplantion. Journal of Visualized Experiments. (88), (2014).
  29. Al-Amran, F. G., Shahkolahi, M. M. Total arterial anastomosis heterotopic heart transplantation model. Transplantation Proceedings. 45 (2), 625-629 (2013).
  30. Hoerstrup, S. P., et al. Modified technique for heterotopic rat heart transplantation under cardioplegic arrest. Journal of Investigative Surgery. 13 (2), 73-77 (2000).
  31. Fry, D. L. Acute vascular endothelial changes associated with increased blood velocity gradients. Circulation Research. 22 (2), 165-197 (1968).
  32. Ahmadi, A. R., et al. Orthotopic Rat Kidney Transplantation: A Novel and Simplified Surgical Approach. Journal of Visualized Experiments. (147), (2019).
  33. Schmid, C., et al. Successful heterotopic heart transplantation in rat. Microsurgery. 15 (4), 279-281 (1994).
  34. Shan, J., et al. A modified technique for heterotopic heart transplantation in rats. Journal of Surgical Research. 164 (1), 155-161 (2010).
  35. Moris, D., et al. Mechanisms of liver-induced tolerance. Current Opinion in Organ Transplantation. 22 (1), 71-78 (2017).
  36. Bickerstaff, A. A., et al. Murine renal allografts: spontaneous acceptance is associated with regulated T cell-mediated immunity. Journal of Immunology. 167 (9), 4821-4827 (2001).
  37. Mottram, P. L., et al. Electrocardiographic monitoring of cardiac transplants in mice. Cardiovascular Research. 22 (5), 315-321 (1988).
  38. Torre-Amione, G., et al. Decreased expression of tumor necrosis factor-α in failing human myocardium after mechanical circulatory support: A potential mechanism for cardiac recovery. Circulation. 100 (11), 1189-1193 (1999).
  39. Goldstein, D. J., et al. Circulatory resuscitation with left ventricular assist device support reduces interleukins 6 and 8 levels. The Annals of Thoracic Surgery. 63 (4), 971-974 (1997).
  40. Tang-Quan, K. R., et al. Non-volume-loaded heart provides a more relevant heterotopic transplantation model. Transplant Immunology. 23 (1-2), 65-70 (2010).
  41. Lakhal-Naouar, I., et al. Transcutaneous immunization using SLA or rLACK skews the immune response towards a Th1 profile but fails to protect BALB/c mice against a Leishmania major challenge. Vaccine. 37 (3), 516-523 (2019).
  42. Sousa-Batista, A. J., et al. Novel and safe single-dose treatment of cutaneous leishmaniasis with implantable amphotericin B-loaded microparticles. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. , (2019).

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Weigle, C. A., Lieke, T., Vondran, F. W. R., Timrott, K., Klempnauer, J., Beetz, O. An Immunological Model for Heterotopic Heart and Cardiac Muscle Cell Transplantation in Rats. J. Vis. Exp. (159), e60956, doi:10.3791/60956 (2020).

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