用细胞内快速光化学氧化蛋白质对细胞内蛋白质进行特征化

1. 设置IC-FPOP流系统 要开始装配流系统，请使用裂解石切割熔融石英的大小。IC-FPOP 流量系统需要 4 个 12 厘米和 17 厘米熔融石英，内径 （ID） 为 450 μm，外径 （OD） 为 670 μm，2 44 厘米，ID 为 75 μm，OD 为 360 μm，最后两个 57 厘米，ID 为 150 μm，OD 为 360 μm。注：切割二氧化硅管时，轻轻刮掉聚酰亚胺涂层，然后弯曲以获得最干净的切口。检查以确保它是直切（这是确保没有堵塞或泄漏形式所必需的）。 使用纳米紧套筒（0.0155″ID X 1/16″ OD 360 μm OD 二氧化硅管和 0.027″ ID X 1/16″ OD 为 670 μm OD 硅硅管）设置 15 个连接，与超级跳蚤螺母 PEEK 1/4-28 平底 1/16″ OD 和超级跳蚤 ferrule w/SST 环， Tefzel （ETFE），1/4-28 平底，用于 1/16″ OD。根据制造商的协议构造连接（图 1）。 将 6 个小圆柱形磁铁放入一个 500 μL 注射器中。将注射器与另外 500 μL 注射器和两个 5 mL 注射器一起填充缓冲液并去除空气。如图2A所示，注射器泵上的位置。注：5 mL注射器大于500μL注射器，因此需要一个垫器来同时拧紧所有注射器到位（图2B）。 拧紧注射器泵塞，使当电机熄火时，细胞注射器还剩下大约 50 μL。这将为磁力搅拌器留出空间。（图2C-D）。注意：如果注射器泵对磁铁施加压力，它们会堵塞注射器，并可能导致注射器破裂。 使用 Luer 适配器，将手动阀连接到每个注射器。组装硅管，如图3所示。注：将线与单元格 + H2O2一直穿过十字到另一侧。然后将其插入 450 μm ID 硅管中。5 mL注射器中的护套缓冲液的流动速度将快于细胞和H2O2。两侧的护套缓冲器将水动力聚焦到一条线进行辐照。 将流系统放置在激光旁边。使用打火机，烧掉 450 μm ID 管上的二氧化硅涂层，为激光照射打下一扇窗。 将包含六个磁铁的细胞注射器上方放置一个磁性搅拌器。 将注射器泵设置为 492.4 μL/min，最终流速为 1，083.3 μL/min。 流缓冲液通过系统三次冲洗系统并测试是否有泄漏。 使用凸透镜将兴奋激光聚焦在二氧化硅管上。聚焦后，通过在二氧化硅管后面放置一小张纸来测试辐照窗口，然后打开激光。测量从辐照中烧毁的区域。使用辐照窗口和流速计算所需的激光频率，以获得零的排除分数。注：IC-FPOP实验推荐的激光能量为±120 mJ。要获得辐射窗口为 2.58 mm 且流量为 1083.3 μL/min 的排除分数 0，频率需要为 44。下面是在已知辐照窗口、流速和排除分数时计算激光频率所需的方程。其中w是 nL 的体积，x 是激光光点宽度（以毫米为单位），y 是以 μm 为单位的二氧化硅管 ID，v 是总体积（以 μL 为单位），b 是排除分数，a 是流速（以 μL/min 为单位），f 是频率（以 Hz 为单位）。 2. 使淬火和 H2O2 制造含有100 mM N-tert-丁基-α-苯丙烯硝基硝基烯（PBN）和100 mM N、N’-二甲基硫尿酸（DMTU）的淬火。每个样品的淬火量为11 mL，分为50 mL锥形管。 稀释 H2O2至 200 mM。每个样品需要500μL的H2O2。注：淬火器可在前一天进行，并储存在4°C过夜，防止光线照射。H2O2应该在实验日重新出现。 3. 收集细胞 在T175烧瓶中生长细胞，达到约70-90%的汇合度。 取出介质，用缓冲液冲洗。注：使用的典型缓冲液是细胞培养等级Dulbecco的磷缓冲盐水（DPBS）或汉克的平衡盐溶液（HBSS）。 使用胰蛋白酶-EDTA或使用刮刀分离细胞。 分离后重新悬浮在 10 mL 的缓冲区中，并计算单元格。 向下旋转，取出缓冲液和胰蛋白酶-EDTA，然后重新挂起以产生 2 x 106个单元/mL。 每个样品的细胞的脂肪500 μL。注：对于每种情况，至少制作3个激光样品，3个没有激光控制。 4. 执行 IC-FPOP 将两个 5 mL 注射器与缓冲液填充，500 μL 注射器包含磁铁与细胞，最后 500 μL 注射器与 H2O2。打开磁性搅拌器。 将220μL二甲基硫氧化物（DMSO）刺到一个等位淬火，轻轻混合，放在流系统后面，以收集辐照样品。DMSO的加入将抑制内源性二氧化二氮还原酶。 打开激光，等待 7 s，然后打开流系统。 样品完成流动后，关闭激光，轻轻将淬火与采集的样品混合。在步骤 4.5 和 4.6 中，将此放在侧面。 用悬浮到细胞的缓冲液填充所有四个注射器，然后通过流动系统流动。 系统完成冲洗后，重复步骤 4.1 和 4.2。无需照射即可启动流量。这是没有激光控制，以解释细胞中的背景氧化。 当下一个样品运行时，以 450-800 x g向下旋转前一个样品 5 分钟，取出溶剂，然后重新悬浮在细胞裂液缓冲液（如放射免疫沉淀测定 （RIPA） 缓冲液）的 100 μL 中。 将样品转移到微离心管，并在液氮中闪冻结。 当所有样品都运行完后，拆解流系统进行清洁。丢弃用过的二氧化硅管，在50%水中通过1小时声波清洁所有其他连接：50%甲醇。根据制造商的说明清洁注射器。 5. 文摘 消化整个细胞水乳。首先在95°C下解冻样品，加热10分钟。 加热后，将冰上的碎水器冷却 15 分钟。 加入25个单位的核酸酶来消化DNA和RNA，并在温带室孵育15分钟。 在4°C下，使用16，000 x g的台式离心机旋转样品10分钟。 收集上清液并将其转移到干净的微离心管。 使用蛋白质测定试剂盒检查蛋白质浓度。 将20-100μg样品转移到清洁的微离心管中，并带到100μL。 在50°C下用20mM二硫硫醇（DTT）减少样品45分钟。 在室温下冷却样品 15 分钟。 在室温下，阿尔基酸盐与20mM碘酰胺（IAA）一起，20分钟，防止光线照射。 以1：4比蛋白质添加预冷却丙酮：丙酮。混合样品，并放置在-20°C过夜。 第二天早上，在4°C下以16，000 x g旋转样品10分钟。 取出上清液，加入50 μL的90%预冷丙酮。混合样品，在4°C下以16，000 x g旋转5分钟。 取出丙酮，让样品干燥，将微离心机的盖子打开，顶部可用无绒擦拭。样品干燥后，用10mM Tris缓冲pH8重新悬浮蛋白颗粒。 在 40 μL 的 10 mM Tris 缓冲 pH 8 中重新悬浮 20 μg 的胰蛋白酶。加入2μg胰蛋白酶（质量：质量比为1胰蛋白酶：50个样品）。在37°C下孵化样品过夜。 第二天早上，使用肽测定检查肽浓度。在去除肽测定的样品后，通过在样品中加入formic酸来淬火（最终浓度为5%的福酸）来淬火酶消化。 确定最终肽浓度后，将每个样品的10μg转移到清洁的微离心管中。这可确保分析每个样本的相同数量。使用真空离心机干燥样品。一旦干燥重新悬浮与20μL的质谱等级0.1%的体酸。将样品传输到自动采样小瓶。 6. 液相色谱-坦平质谱仪 要本地化 FPOP 修改，请使用 LC-MS/MS 分析分析消化的细胞裂化酶。 在水中（A）中使用0.1%的甲酸移动相，在醋酸 （B） 中使用 0.1% 的甲酸。 将 0.5 μg 样品装载到 180 μm x 20 mm C18（5 μm 和 100°）陷印柱上，用 99% （A） 和 1% （B） 清洗样品 15 分钟。 使用 75 μm x 30 厘米 C18（5 μm 和 125 °） 分析柱，运行流速为 0.300 μL/min 的分析分离方法，从 3% （B） 开始一分钟，然后从 1-2 分钟升到 10%（B）。下一个斜坡从2-100分钟到45%（B），然后从100-110分钟到100%（B）。从110-115分钟按住100%（B）来清洁柱子。 将 MS 采集方法设置为分辨率为 60，000，m/z 扫描范围为 375-1500。将自动增益控制 （AGC） 目标设置为 5.0 x 105，最大喷射时间为 50 ms。 在 MS 采集期间，选择电荷状态为 2-6 的前体离子，通过数据依赖采集 （DDA） 进行隔离，隔离窗口为 1.2 m/z，周期时间为 4 s。 选择强度阈值为 5.0 x 104的肽进行 HCD 激活，将标准化能量设置为 32%。在采集 1 MS/MS 后，将肽排除在 60 s. 将 MS/MS 分辨率设置为 15，000，AGC 目标为 5.0 x 104，最大喷射时间为 35 ms。 7. 数据处理 根据相关蛋白质数据库和相关消化酶，搜索可用蛋白质分析软件上的 RAW 文件。在这里，使用瑞士-Prot Homo Sapiens 数据库和胰蛋白酶。 将前体质量设置为在 350 到 5，000 Da 之间搜索，质量公差为 10 ppm。最多只能有 1 个缺失的裂解部位，肽长度在 6 到 144 残留物之间。这些限制有助于数据库搜索。 将碎片离子的最大质量公差设置为 0.02 Da，将卡酰胺甲基 （+57.021） 作为静态修饰，并将 17 种氨基酸的所有 FPOP 修饰作为动态修饰（图 4是用于检测 FPOP 修改的蛋白质分析工作流的一个示例）。注：由于对羟基基反应性较低，因此搜索中不包括对丝氨酸和硫氨酸的FPOP修饰。 使用虚假发现率为 1% 和 5% 的诱饵数据库进行搜索 一旦文件完成搜索计算FPOP修改的范围。开放式蛋白质ome发现器2.2，出口序列，修饰位置，蛋白质加入，频谱文件，前体丰度和保留时间信息。从公式 4 计算修改范围：EIC 区域修改是具有羟基基修饰的特定肽的色谱区域。EIC 区域是该特定肽的改性和非修饰区域的总色谱面积。氧化程度在具有辐射和无辐照的样品中计算。样品省略辐照（控制）占任何背景氧化，可能存在于H2O2暴露前后的细胞中。从辐照样品中减去控件，以帮助隔离 FPOP 的特定修改。