細胞内高速光化学タンパク質による細胞タンパク質の特性分析

1. IC-FPOP フローシステムの設定 流れシステムの組み立てを開始するには、切断石を使用して融合したシリカをサイズに切ります。IC-FPOPフローシステムは、内径(ID)450μm、外径(OD)670μm、24cm、40cm、ID75μm、OD360 μmの4つの12cmと17cmの融合シリカが必要です。、そして最後に150 μmのIDおよび360 μmのODの2つの57 cm。注:シリカチューブを切断するときは、ポリイミドコーティングを静かに削り取り、最もきれいなカットを得るために曲げます。それがまっすぐなカットであることを確認してください(これは、ブロックや漏れフォームを確認するために必要です)。 ナノタイトなスリーブ(0.0155″ID X 1/16″OD 360 μm ODシリカチューブ用)と0.027″ID X 1/16″OD 670 μm ODシリカチューブを使用して15接続を設定し、スーパーフラレンスナットPEEK 1/4-28フラットボトム1/16″ODと超大相場フェルレ テフゼル(ETFE)、1/4-28フラットボトム、1/16″OD。製造元のプロトコルに従って接続を構築します (図 1)。 500 μL シリンジ 1 個に小さな円筒形のマグネットを6個入れる。このシリンジに、別の500 μLシリンジと2本の5 mLシリンジをバッファーで充填し、空気を取り除く。図2Aに示すように、シリンジポンプ上の位置。注意:5 mLのシリンジは500μLのシリンジより大きいので、すべてのシリンジを同時に締めるスペーサーが必要です(図2B)。 モーターが失速したときにセルシリンジが約50μL残るように、シリンジポンプストッパーを締めます。これは磁気スターラーのための余地を残します。(図 2C-D)注意:注射器ポンプが磁石に圧力をかけると、注射器が詰まり、注射器が破損する可能性があります。 Luer アダプターを使用して、手動バルブを各シリンジに接続します。図3に示すようにシリカチューブを組み立てます。メモ:セル+ H2O2を使用して、十字を通って反対側まで行を通します。その後、450 μm ID シリカチューブに挿入します。5 mL シリンジ内のシースバッファーは、細胞およびH2 O2よりも速い速度で2流れます。両側のシースバッファーを使用すると、細胞は、照射のための単一のラインに流体力学的に集中されます。 レーザーの横の位置流れシステム。ライターを使用して、450 μm ID チューブのシリカコーティングを焼き払い、レーザー照射用の窓を作ります。 6つの磁石を含むセルシリンジの上に磁気攪拌機を置きます。 シリンジポンプを492.4 μL/minに設定し、最終流量1,083.3 μL/minをシステム内のフローバッファに3回設定して、システムをフラッシュし、漏れがないかテストします。 凸レンズを使用して、エキシマレーザーをシリカチューブに焦点を当てます。焦点を合わせると、シリカチューブの後ろに小さな紙を置いて照射窓をテストし、レーザーをオンにします。照射から焼けた領域を測定します。照射窓と流量を使用して必要なレーザー周波数を計算し、ゼロの除外分を得ます。注: IC-FPOP 実験で推奨されるレーザーエネルギーは 120 mJ 以上です。照射窓が2.58mm、流量が1083.3 μL/minの除外分率0を取得するには、周波数を44にする必要があります。照射窓、流量、排除分がわかっている場合にレーザー周波数を計算するために必要な式を以下に示します。ここで、wはnLの体積、xはμmのレーザースポット幅、yはμmのレーザー・スポットID、vはμLの総体積、bは除外分数、aはμL/minの流量、fはHzの周波数である。 2. クエンチとH2O2を作る 100 mM N-tert-ブチルアルファフェニルニトロン(PBN)と100 mM N,N’-ジメチルチオウラ(DMTU)を含むクエンチを作ります。アリコート11 mLの各サンプルのクエンチを50 mL円錐管に入れ。 希釈H2O2〜200mM.22各サンプルは、500 μL の H 2 O2を必要とします。注:クエンチは前日に行われ、光から保護された一晩4°Cで保管することができます。H2O2は実験の日に新鮮にする必要があります。2 3. セルを収集する T175フラスコの細胞を約70~90%の合流まで成長させます。 メディアを取り外し、バッファですすいします。注:使用する典型的なバッファーは、セル培養グレードのDulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)またはハンクのバランス塩溶液(HBSS)です。 トリプシンEDTAまたはスクレーパーを使用してセルを取り外します。 一度脱離したバッファの10 mLで再中断し、セルをカウントします。 スピンダウンし、バッファーとトリプシン-EDTAを取り外し、再中断して2 x 106セル/mLを作ります。 アリコート1サンプル当たりの細胞の500μL。注:各条件に対して、最低3つのレーザーサンプルと3つのレーザーコントロールを作ってください。 4. IC-FPOPの実行 2つの5 mLシリンジをバッファー、磁石を含む500 μLシリンジをセルで充填し、最後の500 μLシリンジをH2O2で充填します。磁気スターラーをオンにします。 220 μLのジメチルスルホキシド(DMSO)のスパイクをクエンチの1アリコートに、穏やかに混合し、照射されたサンプルを収集するためにフローシステムの後ろに置きます。DMSOの添加は、内因性メチオニンスルホキシド還元剤を阻害します. レーザーをオンにし、7 s待ってから、フローシステムをオンにします。 サンプルの流れが終わったら、レーザーをオフにして、集めたサンプルと軽くクエンチを混ぜます。ステップ 4.5 および 4.6 の間に、これを横に置きます。 セルが懸濁しているバッファーで 4 つのシリンジをすべて満たし、フロー システムを通してフローします。 システムのフラッシュが完了したら、手順 4.1 と 4.2 を繰り返します。照射せずに流れを開始します。これは、細胞内のバックグラウンド酸化を考慮したレーザー制御ではありません。 次のサンプルが実行されている間、前のサンプルを450-800 x gで5分間回転させ、溶媒を取り除き、放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)バッファーのような細胞溶解バッファーの100 μLで再懸濁します。 サンプルをマイクロ遠心チューブに移し、液体窒素でフリーズします。 すべてのサンプルの実行が終了したら、フローシステムを分解してクリーニングします。使用したシリカチューブを捨て、50%の水で1時間超音波処理することによって他のすべての接続をきれいにする:50%メタノール。メーカーの指示に従って注射器を清掃してください。 5. ダイジェスト 細胞全体のライセートを消化します。サンプルを解凍し、95 °Cで10分間加熱します。 加熱後、氷の上で15分間、ライセートを冷やします。 DNAとRNAを消化するためにヌクレアーゼを25単位加え、室内温帯で15分間インキュベートします。 4°Cで10分間16,000 x gの卓上遠心分離機を使用してサンプルをスピンします。 上清を集め、きれいなマイクロ遠心チューブに移します。 タンパク質アッセイキットを使用してタンパク質濃度を確認します。 20~100 μgのサンプルをクリーンマイクロ遠心チューブに移し、100 μLにします。 20 mM ジチオトレオトール (DTT) を 50 °Cで 45 分間低減します。 室温でサンプルを15分間冷却します。 アルキル酸と20 mMヨードアセトアセトアミド(IAA)を室温で20分間、光から保護。 1:4比タンパク質で予冷アセトンを加える: アセトン.サンプルを混合し、一晩で -20 °Cに置きます。 翌朝、4°Cで10分間16,000 x gでサンプルを回す。 上清を取り除き、90%前チルドアセトンの50μLを加えます。サンプルを混合し、4 °Cで5分間16,000 x gでスピンダウンします。 アセトンを取り除き、マイクロ遠心分離機のキャップを上を覆う糸くずフリーワイプで開いたままにしてサンプルを乾燥させます。サンプルを乾燥させた後、10 mM TrisバッファーpH8でタンパク質ペレットを再懸濁する。 トリプシン20 μgを40 μLの10 mM TrisバッファpH 8で再懸濁します。トリプシンを2μg加えます(質量:質量比1トリプシン:50サンプル)。一晩で37°Cでサンプルをインキュベートする。 翌朝、ペプチドアッセイを用いてペプチド濃度を確認する。ペプチドアッセイ用にサンプルを除去した後、サンプルにギ酸を加えてトリプシン消化をクエンチします(最終濃度は5%のギ酸です)。 最終的なペプチド濃度が決定されたら、各サンプルの10 μgをクリーンマイクロ遠心分離チューブに移します。これにより、各サンプルの同じ量が分析されます。真空遠心分離機を使用してサンプルを乾燥させます。乾燥すると、20 μLの質量分析グレード 0.1% ギ酸で再懸濁します。オートサンプラーバイアルにサンプルを転送します。 6. 液体クロマトグラフィータンデム質量分析 FPOPの改変を局所化するために、LC-MS/MS分析を用いて消化された細胞のライセートを分析する。 水中(A)で0.1%のギ酸、アセトニトリル(B)で0.1%のギ酸の移動相を使用してください。 サンプルを180 μm x 20 mm C18 (5 μm および 100 Å) のトラッピングカラムに 0.5 μg 積み込み、サンプルを 99%(A)、1%(B)で 15 分間洗浄します。 75 μm x 30 cm C18 (5 μm および 125 Å) 分析カラムを使用して、1 分の 3% (B) から 0.300 μL/min の流量で分析分離法を実行し、1 ~ 2 分から 10% (B) までランプします。次のランプは2-100分から45%(B)、100-110分から100%(B)にし、110-115分から100%(B)に保持してカラムを清掃します。 M/z スキャン範囲が 375 ~ 1500 の MS 取得方法の解像度が 60,000 に設定されるようにします。自動ゲイン制御 (AGC) ターゲットを 5.0 x 105に設定し、最大射出時間は 50 ミリ秒に設定します。 MS取得中に、1.2 m/zの分離ウィンドウとサイクル時間が4秒のデータ依存取得(DDA)を介して単離する電荷状態2~6の前駆イオンを選択し、HCD活性化に対して強度しきい値5.0 x 104のペプチドを選択し、正規化エネルギーを32%に設定します。60 sの1 MS/MS取得後にペプチドを除外し、AGCターゲットを5.0 x 104、最大射出時間を35 msで15,000に設定します。 7. データ処理 関連するタンパク質データベースと関連する消化酵素に対して利用可能なタンパク質分析ソフトウェア上のRAWファイルを検索します。ここでは、スイスプロトホモサピエンスデータベースとトリプシンを使用します。 350 ~ 5,000 Da の範囲で検索し、質量許容値を 10 ppm にする前駆体質量を設定します。6〜144残基の間のペプチド長を有する切断部位を最大1個見逃すことができます。これらの制限により、データベースの検索が容易になります。 動的修飾として17アミノ酸からのFPOP修飾と静的修飾としてカルバミドメチル(+57.021)を有するフラグメントイオンの最大質量許容範囲を0.02Daに設定します(図4はFPOP修飾を検出するために使用されるタンパク質分析ワークフローの一例です)。注:セリンとスレオニンのFPOPの変更は、ヒドロキシルラジカルとの反応性が低いため、検索には含まれていません。 誤検出率が 1% と 5% のおとりデータベースで検索します。 ファイルの検索が終了すると、FPOP の変更の範囲が計算されます。Open Proteome Discoverer 2.2、エクスポートシーケンス、変更場所、タンパク質の受動、スペクトルファイル、前駆体の豊富さ、保持時間情報。数式 4 から修正の範囲を計算します。EIC領域改変は、ヒドロキシルラジカル修飾を有する特定のペプチドのクロマトグラフィー領域である。EIC領域は、その特定のペプチドの改変領域と未修飾領域の両方のクロマトグラフィー領域です。酸化の程度は、照射の有無にかかわらずサンプルで計算されます。サンプルの省略照射(対照)は、H2 O2曝露の前後に細胞内に存在する可能性のある任意のバックグラウンド酸化2を占める。コントロールは、FPOP固有の変更を分離するのに役立つ照射サンプルから差し引かれます。