Характеристика клеточных белков с в-клеточной быстрой фотохимической окисления белков

1. Настройка системы потока IC-FPOP Чтобы начать сборку системы потока, вырежьте сливку с помощью расщепления камня по размеру. Система потока IC-FPOP требует четырех 12 см и одного 17 см сливного кремния с внутренним диаметром (ID) 450 мкм и внешним диаметром (OD) 670 мкм, 24 см и один 40 см с идентификатором 75 мкм и OD 360 мкм , и, наконец, два 57 см с ID 150 мкм и OD 360 мкм.ПРИМЕЧАНИЕ: При резке кремнезема труб, аккуратно соскребать полиимидовое покрытие, и согнуть, чтобы получить чистый разрез. Проверьте, чтобы убедиться, что это прямой разрез (это необходимо, чтобы убедиться, что нет завалов или утечек форме). Настройка 15 соединений с использованием нано-жесткие рукава (0.0155 “ID X 1/16″ OD для 360 мкм OD силика труб и 0,027 ” ID X 1/16″ OD для 670 мкм OD кремния труб) с супер flangeless орех PEEK 1/4-28 плоский дно для 1/16 ” Тефцель (ETFE), 1/4-28 плоское дно, для 1/16″ OD. Построить соединения в рамках протокола производителя(рисунок 1). Поместите 6 маленьких цилиндрических магнитов в один шприц в 500 л. Заполните этот шприц вместе с еще 500 шприцев и двумя шприцев 5 мл с буфером и удалить воздух. Позиция на шприц насос, как показано на рисунке 2A.ПРИМЕЧАНИЕ: Шприцы размером 5 мл больше, чем 500 шприцев, поэтому для затягивания всех шприцев одновременно необходим прокладка(рисунок 2B). Затяните шприц пробка насоса так, что шприц клетки имеет примерно 50 Л слева, когда двигатель останавливается. Это оставит место для магнитных мешалки. (Рисунок 2C-D).ВНИМАНИЕ: Если шприц насос оказывает давление на магниты, они будут варенье шприц и может привести к шприц сломать. Используя адаптер Luer, подключите ручной клапан к каждому шприцу. Соберите силика труб, как показано на рисунке 3.ПРИМЕЧАНИЕ: Нить линии с клетками H2O2 весь путь через крест на другую сторону. Затем вставьте его в 450 мкм ID кремнезема труб. Буферы оболочки в шприцу 5 мл будут течь быстрее, чем клетки и H2O2. С буферами оболочки с обеих сторон, клетки будут гидродинамически сосредоточены в одну линию для облучения. Система потока позиции рядом с лазером. Используя зажигалку, сжечь кремнезема покрытие на 450 мкм ID трубки, чтобы сделать окно для лазерного облучения. Поместите магнитный мешалку над клеточном шприцем, содержащим шесть магнитов. Установите шприц насос до 492,4 л /мин для конечной скорости потока 1083,3 л / м. Поток буфера через систему в три раза, чтобы промыть систему и проверить на любые утечки. Сосредоточьте эксимерный лазер на кварцевые трубки с помощью выпуклой линзы. После сосредоточения, проверить облучение окно, поместив небольшой лист бумаги за кремнезема труб и включить лазер. Измерьте регион, сгоревший от облучения. Рассчитайте необходимую частоту лазера с помощью окна облучения и скорости потока, чтобы получить долю исключения нуля.ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемая лазерная энергия для эксперимента IC-FPOP составляет 120 мДж. Чтобы получить исключенную фракцию 0 с окном облучения 2,58 мм и скоростью потока 1083,3 л/мин, частота должна быть 44. Ниже приведены уравнения, которые необходимы для расчета частоты лазера, если известно окно облучения, скорость потока и фракция исключения.где w объем в nL, x ширина пятна лазера в mm, y будет ID tubing кремнезема в мкм, v будет полным томом в ЗЛ, b будет фракцией исключения, a будет тарифпотока потока в л/мин, и f частота в Hz. 2. Сделать утолить и H2O2 Сделать утоление, содержащее 100 мМ N-терт-Бутил-альфа-фенилнитрон (PBN) и 100 мМ N, N’-dimethylthiourea (DMTU). Aliquot 11 мл утоления для каждого образца в 50 мл конической трубки. Разбавить H2O2 до 200 мМ. Каждый образец требует 500 л H2O2.ПРИМЕЧАНИЕ: Утоление может быть сделано накануне и хранится при 4 градусах Цельсия на ночь, защищенном от света. H2O2 следует сделать свежим в день экспериментов. 3. Собирать ячейки Выращивайте клетки в колбе T175 примерно до 70-90% сближание. Удалите носители и промыть буфером.ПРИМЕЧАНИЕ: Типичными буферами для использования являются фосфатно-буферный солевой раствор Dulbecco (DPBS) или сбалансированный соляной раствор Хэнка (HBSS). Отсоединяйте клетки с помощью либо трипсина-ЭДТА, либо с помощью скребока. После того, как отдельные resuspend в 10 мл буфера и рассчитывать ячейки. Спин вниз, удалить буфер и trypsin-EDTA, и resuspend сделать 2 х 106 ячеек / мл. Aliquot 500 л клеток на образец.ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого условия, сделать как минимум 3 лазерных образцов, и 3 без лазерного управления. 4. Выполнение IC-FPOP Заполните два шприца 5 мл с буфером, 500 л шприц, содержащий магниты с клетками, и окончательный 500 л шприц с H2O2. Включите магнитный мешалку. Спайк в 220 л диметилсульксида (DMSO) к одному аликто утоления, аккуратно перемешать, и место позади системы потока для сбора облученных образцов. Добавление DMSO будет препятствовать эндогенной метионин сульфодоксид редуктазы. Включите лазер, подождите 7 с, а затем включите систему потока. Как только образец заканчивается течет, выключите лазер, и аккуратно смешать утоления с собранным образцом. Поместите это в сторону во время шагов 4.5 и 4.6. Заполните все четыре шприца буфером, в который приостанавливаются клетки, и процвейте его через систему потока. После завершения промывки системы повторите шаги 4.1 и 4.2. Запустите поток без облучения. Это не лазерный контроль для учета фонового окисления в клетках. В то время как следующий образец работает, спина вниз предыдущий образец на 450-800 х г в течение 5 минут, удалить растворитель, и resuspend в 100 злицис буфера лиза клетки, как радиоиммунопреции анализ (RIPA) буфера. Перенос образца в микроцентрифуговую трубку и флэш-заморозку в жидком азоте. Когда все образцы закончат работу, разберите систему подачи для очистки. Откажитесь от использованных кварцевых труб и очистите все остальные соединения, соникируя на 1 ч в 50% воды: 50% метанола. Очистите шприцы в рамках инструкций производителя. 5. Дайджест Переварить всю клетку lysate. Начните с оттаивания образцов и нагревайте при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 10 мин. После нагрева, охладить лизат на льду в течение 15 минут. Добавьте 25 единиц нуклеазы для переваривания ДНК и РНК и инкубировать в комнате умеренный в течение 15 минут. Образцы спина с помощью центрифуги столешницы при 16 000 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия. Соберите супернатант и перенесите его в чистую микроцентрифуговую трубку. Проверьте концентрацию белка с помощью набора анализ овак белка. Перенесите 20-100 мкг образца в чистую микроцентрифуговую трубку и доведите до 100 л. Уменьшите образцы с 20 мМ дитиотрейотол (DTT) при 50 градусах по Цельсию в течение 45 мин. Охладите образцы при комнатной температуре в течение 15 мин. Алкилат с 20 мМ йодоацетамидом (IAA) при комнатной температуре в течение 20 минут защищен от света. Добавьте предварительно охлажденный ацетон в соотношении 1:4: ацетон. Смешайте образцы и поместите в -20 градусов на ночь. На следующее утро, спина образцов на 16000 х г в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия. Удалить супернатант и добавить 50 л 90% предварительно охлажденный ацетон. Смешайте образцы и вращайтесь при 16 000 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия. Удалите ацетон и дайте образцам высохнуть, оставив крышки микроцентрифуга открытыми с ворсом свободной салфеткой, покрывающей верхнюю часть. После того, как образцы высохли, resuspend протеиновые гранулы с 10 мм Tris буфер рН 8. Отрептить 20 мкг трипсина в 40 qL 10 мм Tris буфер рН 8. Добавьте 2 мкг трипсина (масса: соотношение массы 1 трипсина: 50 образцов). Инкубировать образцы при 37 градусах Цельсия на ночь. На следующее утро проверьте концентрацию пептида с помощью пептида. После того, как образец был удален для пептидного асссиса, утолить пищеварение трипсина, добавив в образцы формальную кислоту (окончательная концентрация составляет 5% для кислоты). Как только окончательная концентрация пептида определяется, перенесите 10 мкг каждого образца в чистую микроцентрифуговую трубку. Это гарантирует, что анализируется одинаковое количество каждого образца. Высушите образец с помощью вакуумной центрифуги. После высушивания повторно приостанавливается с 20 ЗЛ масс-спектрометрии класса 0,1% для мистовой кислоты. Передача образцов на флаконы автосэмпера. 6. Ликвидная хроматография-Тандемская масс-спектрометрия Для локализации модификаций FPOP анализируйте переваренный клеточный лизат с помощью анализа LC-MS/MS. Используйте мобильные фазы 0,1% для модной кислоты в воде (A) и 0,1% для мической кислоты в ацетонитриле (B). Загрузите 0,5 мкг образца на 180 мкм х 20 мм C18 (5 мкм и 100 евро) захвата колонки и мыть образец с 99% (A) и 1% (B) в течение 15 мин. Используя аналитическую колонку C18 (5 мкм и 125 м), запустите аналитический метод разделения с частотой потока 0,300 мл/мин, начиная с 3% (B) в течение одной минуты, затем наращивай до 10% (B) с 1-2 мин. Следующий пандус до 45% (B) от 2-100 мин, затем 100% (B) от 100-110 мин. Очистите колонну, удерживая на 100% (B) от 110-115 мин. Восстановление колонны путем ramping до 3% (B) от 115-116 мин и удерживайте на 3% (B) от 116-160 мин. Установите метод приобретения MS, чтобы иметь разрешение 60000 с диапазоном м /з сканирования 375-1500. Установите цель автоматического управления усилением (AGC) до 5,0 x 105 с максимальным временем впрыска 50 мс. Во время приобретения MS выберите ионы предшественников с состояниями заряда 2-6 для изоляции через приобретение зависимых данных (DDA) с изоляционным окном 1,2 м/з и временем цикла 4 с. Выберите пептиды с порогом интенсивности 5,0 х 104 для активации HCD с нормализованным набором энергии до 32%. Исключить пептиды после 1 MS / MS приобретения для 60 s. Установите MS / MS резолюции до 15000 с целью AGC 5,0 х 104 и максимальное время инъекции 35 мс. 7. Обработка данных Поиск RAW файлов на доступных программное обеспечение анализа белка против соответствующей базы данных белка и соответствующих фермента дайджеста. Здесь используйте швейцарскую базу данных Homo Sapiens и трипсин. Установите массу предшественника для поиска от 350 до 5000 Da и массовой допуск 10 ppm. Там может быть не более 1 пропущенного расщепления сайта с пептидной длины от 6 до 144 остатков. Эти ограничения облегчают поиск базы данных. Установите максимальной массоустойчивости фрагментов до 0,02 Da с карбамидоэтилом (No57.021) в качестве статической модификации и всех модификаций FPOP из 17 аминокислот в качестве динамической модификации(рисунок 4 является примером рабочего процесса анализа белка, используемого для обнаружения модификаций FPOP).ПРИМЕЧАНИЕ: FPOP модификации на серинку и молотин не включены в поиск из-за их низкой реактивности с гидроксиловыми радикалами. Поиск с базой данных приманки с ложной скоростью обнаружения 1% и 5%. После завершения поиска файлы вычисляют степень модификации FPOP. Открытый Proteome Discoverer 2.2, экспортная последовательность, места модификации, присоединение белка, файл спектра, изобилие прекурсоров и информация о времени удержания. Рассчитайте степень модификации из уравнения 4:Измененная область EIC представляет собой хроматографическую область специфического пептида с гидроксильной радикальной модификацией. Область EIC представляет собой общую хроматографическую область как модифицированных, так и неизмененных областей этого специфического пептида. Степень окисления рассчитывается в образцах с облучением и без его облучения. Образец опускания облучения (контроля) объясняет любое фоновое окисление, которое могло присутствовать в клетках до и после воздействия H2O2. Элементы управления вычитаются из образцов облучения, чтобы помочь изолировать FPOP конкретных модификаций.