Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins in the C2C12 Myoblast Cell Line Using Small-Hairpin (sh)RNA Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins in the C2C12 Myoblast Cell Line Using Small-Hairpin (sh))RNA Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins in the C2C12 Myoblast Cell Line Using Small-Hairpin (sh)RNA Stable

Les protéines de matrice extracellulaire (ECM) fournissent le soutien structurel pour tous les tissus, la communication de cellules-cellules de médiation, et déterminent le destin de cellules. La formation et le remodelage dynamique de l’ECM sont donc essentiels pour maintenir l’homéostasie des tissus et des organes^1,2. Les variantes pathologiques dans plusieurs gènes codant pour des protéines d’ECM donnent lieu à des désordres musculo-squelettiques avec des phénotypes s’étendant des dystrophies musculaires à la construction pseudomouscular^3,4. Par exemple, les variantes pathogènes dans ADAMTSL2 causent la dysplasie géléophile extrêmement rare de désordre musculo-squelettique, qui présente avec la construction pseudomusculaire, c.-à-d., une augmentation apparente de la masse de muscle squelettique^5. Avec les données d’expression génique chez la souris et l’homme, cela suggère un rôle pour ADAMTSL2 dans le développement des muscles squelettiques ou l’homéostasie^6,7.

Le protocole que nous décrivons ici a été développé pour étudier le mécanisme par lequel ADAMTSL2 module le développement de muscle squelettique et/ou l’homéostasie dans un arrangement de culture cellulaire. Nous avons poignardé ADAMTSL2 dans la lignée de myoblastes murine C2C12. Les myoblastes C2C12 et leur différenciation en myotubes est un modèle de culture cellulaire bien décrit et largement utilisé pour la différenciation des muscles squelettiques et la bioingénierie des muscles squelettiques^8,9. Les cellules C2C12 passent par des étapes distinctes de différenciation après le retrait de sérum, ayant pour résultat la formation des myotubes multinucleated après 3-10 jours dans la culture. Ces étapes de différenciation peuvent être surveillées de façon fiable en mesurant les niveaux d’ARNm de gènes marqueurs distincts, tels que la myod, la myogénine ou la chaîne lourde de myosine (MyHC). Un avantage de générer des renversements de gènes stables dans les cellules C2C12 est que les gènes qui sont exprimés à des stades ultérieurs de la différenciation C2C12 peuvent être ciblés plus efficacement, par rapport à l’élimination transitoire réalisée par l’ARN à petite interférence (si), qui dure généralement de 5 à 7 jours après la transfection, et est influencé par l’efficacité de la transfection. Un deuxième avantage du protocole tel que décrit ici est la génération relativement rapide de lots de cellules knockdown C2C12 en utilisant la sélection de puromycine. Les solutions de rechange, telles que l’élimination du gène CRISPR/Cas9 ou l’isolement des précurseurs des cellules musculaires squelettiques primaires provenant de souris humaines ou déficientes en gènes cibles, sont techniquement plus difficiles ou nécessitent la disponibilité de biopsies musculaires du patient ou de souris déficientes en gènes cibles, respectivement. Cependant, comme d’autres approches basées sur la culture cellulaire, il ya des limites dans l’utilisation des cellules C2C12 comme modèle pour la différenciation des cellules musculaires squelettiques, tels que la nature bidimensionnelle (2D) de la culture cellulaire mise en place et l’absence de microenvironnement in vivo qui est essentiel pour maintenir indifférenciées cellules précurseurs musculaires squelettiques¹⁰.