小ヘアピン(sh)RNAを用いたC2C12筋芽細胞細胞株系の細胞外マトリックスタンパク質をコードする遺伝子の安定ノックダウン
Summary
小さなヘアピン(sh)RNAを用いてC2C12筋芽細胞(ECM)タンパク質をコードする遺伝子を安定的にノックダウンするプロトコルを提供します。ADAMTSL2を例に、ミオチューブ分化に対するC2C12筋芽細胞間におけるmRNA、タンパク質、および細胞レベルのノックダウン効率の検証方法について説明します。
Abstract
細胞外マトリックス (ECM) タンパク質は骨格筋の発達と恒常性に不可欠です。C2C12筋芽細胞のECMタンパク質をコードする遺伝子の安定したノックダウンは、骨格筋発達におけるこれらのタンパク質の役割を研究するために適用することができる。ここで、ECMタンパク質ADAMTSL2を一例として枯渇させるプロトコルについて、C2C12細胞における小さなヘアピン(sh)RNAを用いた。shRNAプラスミドのトランスフェクションに続いて、安定した細胞をピューロマイシンを用いてバッチ選択した。さらに、これらの細胞株の維持およびmRNA発現、タンパク質発現、およびC2C12分化による表現型分析について説明する。この方法の利点は、比較的速いC2C12ノックダウン細胞の生成と、細胞培養培地中の血清の枯渇時にC2C12細胞を多核化筋管に確実に分化することである。C2C12細胞の分化は、明視野顕微鏡法およびMyoD、ミオゲニン、またはミオシン重鎖(MyHC)などの正規マーカー遺伝子の発現レベルを測定することによってモニタリングされ、ミオチューブへのC2C12ミオブラスト分化の進行を示す。小干渉(si)RNAを有する遺伝子の一過性ノックダウンとは対照的に、C2C12の分化中または筋管成熟中に後に発現する遺伝子は、shRNAを安定して発現するC2C12細胞を生成することによってより効率的に標的化することができる。この方法の限界は、CRISPR/Cas9に基づく遺伝子ノックアウト戦略を用いて克服できる特定のshRNA、ならびに考慮すべきshRNAの潜在的なオフターゲット効果に応じて、ノックダウン効率の変動である。
Introduction
細胞外マトリックス(ECM)タンパク質は、すべての組織に構造的なサポートを提供し、細胞と細胞間の通信を媒介し、細胞の運命を決定します。ECMの形成と動的なリモデリングは、組織および器官の恒常性を維持するために重要である1,2.ECMタンパク質をコードするいくつかの遺伝子における病理学的変異体は、筋ジストロフィーから擬似運動体のビルド3、4に至るまでの形型を有する筋骨格系障害を生じさせる。例えば、ADAMTSL2の病原体変異体は、極めて稀な筋骨格系障害のゲレオフィス性異形成を引き起こし、これは偽筋造り、すなわち骨格筋質量5の明らかな増加を呈する。マウスおよびヒトにおける遺伝子発現データと共に、骨格筋の発達または恒常性6,7におけるADAMTSL2の役割を示唆している。
ここで説明するプロトコルは、ADAMTSL2が細胞培養環境における骨格筋の発達および/または恒常性を調節するメカニズムを研究するために開発された。我々は、マウスC2C12筋芽細胞株においてADAMTSL2を安定的にノックダウンした。C2C12筋芽細胞および筋管への分化は、骨格筋分化および骨格筋生体工学のためのよく記述され、広く使用されている細胞培養モデル8、9である。C2C12細胞は、血清離脱後に明確な分化ステップを経て、培養中3〜10日後に多核化筋管の形成をもたらす。これらの分化工程は、MyoD、ミオゲニン、ミオシン重鎖(MyHC)などの異なるマーカー遺伝子のmRNAレベルを測定することによって確実に監視することができます。C2C12細胞で安定した遺伝子ノックダウンを発生させる利点の1つは、C2C12分化の後期段階で発現する遺伝子を、トランスフェクション後5〜7日間続く小干渉(si)RNAによって達成される一過性ノックダウンと比較して、より効率的に標的にできることであり、トランスフェクション効率の影響を受ける。ここで説明するプロトコルの第2の利点は、プルマイシン選択を用いたC2C12ノックダウン細胞のバッチの比較的高速な生成である。CRISPR/Cas9媒介遺伝子ノックアウトや、ヒトまたは標的遺伝子欠損マウスからの一次骨格筋細胞前駆体の単離などの代替案は、技術的にはより困難であるか、患者の筋肉生検または標的遺伝子欠損マウスの入手可能性をそれぞれ必要とする。しかしながら、他の細胞培養ベースのアプローチと同様に、C2C12細胞の使用には、細胞培養のセットアップの2次元(2D)性質や未分化骨格筋前駆細胞10を維持するために重要な生体内微小環境の欠如などの骨格筋細胞分化モデルとしての使用には限界がある。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、C2C12筋芽細胞におけるECMタンパク質の安定ノックダウンと、筋管へのC2C12筋芽細胞の分化の表現的分析のためのプロトコルを説明する。いくつかの要因が実験の結果を決定し、慎重に検討する必要があります。増殖期のC2C12細胞を維持することは、C2C12細胞をミオブラスト前駆体状態に保つための重要なステップである。一貫して筋管に分化するC2C12細胞の能力を保持することは、i)?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.H.は国立衛生研究所(国立関節炎・筋骨格・皮膚疾患研究所、NIAMS、助成金番号AR070748)と、レニ&ピーター・W・メイ整形外科、アイカーン医学部からの種子資金によって支援されています。シナイ山。
Materials
| Acetone | Fisher Chemical | 191784 | |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423 | |
| Ampicillin | Fisher Bioreagents | BP1760-5 | |
| Automated cell counter Countesse II | Invitrogen | A27977 | |
| Bradford Reagent | Thermo Scientific | P4205987 | |
| C2C12 cells | ATCC | CRL-1772 | |
| Chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Chloroform | Fisher Chemical | 183172 | |
| DMEM | GIBCO | 11965-092 | |
| DMSO | Fisher Bioreagents | BP231-100 | |
| DNase I (Amplification Grade) | Invitrogen | 18068015 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 97068-085 | |
| GAPDH | EMD Millipore | MAB374 | |
| Glycine | VWR Life Sciences | 19C2656013 | |
| Goat-anti-mouse secondary antibody (IRDYE 800CW) | Li-Cor | C90130-02 | |
| Goat-anti mouse secondary antibody (Rhodamine-red) | Jackson Immune Research | 133389 | |
| HCl | Fisher Chemical | A144S | |
| Incubator (Shaker) | Denville Scientific Corporation | 1704N205BC105 | |
| Mercaptoethanol | Amresco, VWR Life Sciences | 2707C122 | |
| Midiprep plasmid extraction kit | Qiagen | 12643 | |
| Myosin 4 (myosin heavy chain) | Invitrogen | 14-6503-82 | |
| Mounting medium | Invitrogen | 2086310 | |
| NaCl | VWR Life Sciences | 241 | |
| non-ionic surfactant/detergent | VWR Life Sciences | 18D1856500 | |
| Paraformaldehyde | MP | 199983 | |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP399-4 | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Penicillin/streptomycin antibiotics | GIBCO | 15140-122 | |
| Petridishes | Corning | 353003 | |
| Polypropylene tubes | Fisherbrand | 149569C | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 33576300 | |
| Puromycin | Fisher Scientific | BP2956100 | |
| PCR (Real Time) | Applied Biosystems | 4359284 | |
| Reaction tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| Reverse Transcription Master Mix | Applied Biosystems | 4368814 | |
| RIPA buffer | Thermo Scientific | TK274910 | |
| sh control plasmid | Sigma-Aldrich | 07201820MN | |
| sh 3086 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092578 | |
| sh 972 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092579 | |
| sh 1977 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092582 | |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Scientific | NanoDrop One C | |
| SYBR Green Reagent Master Mix | Applied Biosystems | 743566 | |
| Trichloroacetic acid | Acros Organics | 30145369 | |
| Trizol reagent | Ambion | 254707 | |
| Trypan blue | GIBCO | 15250-061 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | BP1421 | |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco-Life Technology Corporation | 2085459 | |
| Water (DEPC treated and nuclease free) | Fisher Bioreagents | 186163 | |
| Western blotting apparatus | Biorad | Mini Protean Tetra Cell | |
| Yeast extract | Fisher Bioreagents | BP1422 |
References
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