יציבה מנוק של גנים הקידוד מיקתאי מטריקס חלבונים ב C2C12 Myאובלסט התא באמצעות סיכת ראש קטן (sh) RNA
Summary
אנו מספקים פרוטוקול כדי להפיל גנים מטריקס קידוד מטריצות (ECM) חלבונים ב C2C12 myoblasts באמצעות סיכת ראש קטן (sh) RNA. פילוח ADAMTSL2 כדוגמה, אנו מתארים את השיטות לאימות היעילות של הנוק-אין, חלבון, ורמת הסלולר במהלך C2C12 myoblast כדי לאפשר בידול צינור.
Abstract
מטריצה מסחטות (ECM) חלבונים חיוניים להתפתחות שריר השלד הומאוסטזיס. הנוק-אין יציב של גנים קידוד עבור חלבונים ECM ב C2C12 myoblasts ניתן להחיל על ללמוד את התפקיד של חלבונים אלה בפיתוח שריר השלד. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לרוקן את החלבון ECM ADAMTSL2 כדוגמה, באמצעות סיכת ראש קטן (sh) ב C2C12 תאים. לאחר הזיהום של הפלמידים מרין, תאים יציבים שנבחרו באצווה באמצעות puromycin. אנו מתארים עוד יותר את התחזוקה של קווי התאים האלה ואת הניתוח פנוטימית באמצעות ביטוי mRNA, חלבון ביטוי, ו C2C12 בידול. היתרונות של השיטה הם הדור המהיר יחסית של אורווה C2C12 מלמטה תאים והבידול אמין של תאים C2C12 לתוך מיוקלנים בחברה על דילול הסרום במדיום תרבות התא. הבידול של תאים C2C12 יכול להיות מפוקח על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר ועל ידי מדידת רמות הביטוי של גנים סמן קאנוני, כגון MyoD, מיוגאין, או רירן שרשרת כבדה (Myod) המציין את ההתקדמות של C2C12 myod חוז בידול לתוך מיוכי. בניגוד הסתרה חולף למטה של גנים עם קטן מתערב (si) RNA, גנים מבוטא בשלב מאוחר יותר במהלך C2C12 בידול או במהלך התבגרות ההבשלה ניתן לפלח ביעילות רבה יותר על-ידי יצירת C2C12 תאים באופן מהיר למדי לבטא שרין. מגבלות השיטה הן השונות ביעילות הנוק-אאוט, בהתאם למרין הספציפי שניתן להתגבר על-ידי שימוש באסטרטגיות הסתרה גנטית המבוססות על CRISPR/Cas9, כמו גם השפעות פוטנציאליות מחוץ למטרה של מרין, כי יש לשקול.
Introduction
חלבונים בעלי מטריקס (ECM) מספקים תמיכה מבנית לכל הרקמות, מתווכים בתקשורת תא התא וקובעים את גורל התאים. היווצרות ושיפוץ דינמי של ecm הוא ולכן קריטי כדי לשמור על רקמות ואיברים הומאוסטזיס1,2. משתנים פתולוגיים בקידוד מספר גנים עבור חלבונים ecm להצמיח הפרעות שריר-השלד עם פנוטיפים החל שרירי dystrophies כדי לבנות פסבדו-אקראי3,4. לדוגמה, משתנים פתוגניים ב ADAMTSL2 לגרום מחלת השלד השרירים נדירה ביותר, אשר מציג עם בנייה פסבדו-מולקולרית, כלומר, עלייה לכאורה במסת שריר השלד5. יחד עם ביטוי גנים נתונים בעכבר ובבני אדם, זה מציע תפקיד ADAMTSL2 בפיתוח שריר השלד או הומאוסטזיס6,7.
הפרוטוקול שאנו מתארים כאן פותחה כדי ללמוד את המנגנון שבו ADAMTSL2 שריר השלד פיתוח שרירים ו/או הומאוסטזיס בסביבה תרבות התא. הADAMTSL2 באופן בלתי נשכח. בתוך קו התאים של מורטין C2C12 מיחוז C2C12 myoblasts ואת הבידול שלהם לתוך מיופופרות הוא מתואר היטב בשימוש נרחב מודל התרבות התא לבידול שריר השלד שריר השלד ביו-8,9. C2C12 תאים לעבור שלבים בידול ברורים לאחר הנסיגה סרום, וכתוצאה מכך היווצרות של מיוקליום של החברה לאחר 3-10 ימים בתרבות. אלה שלבים בידול יכול להיות מפוקח באופן אמין על ידי מדידת רמות mRNA של גנים שונים סמן, כגון MyoD, מיוגאין, או רירן שרשרת כבדה (Myod). אחד היתרונות של הפקת הC2C12 גן יציב בתאי התאים הוא כי הגנים באים לידי ביטוי בשלבים מאוחרים יותר של C2C12 בידול יכול להיות ממוקד יותר ביעילות, לעומת הסתרה חולף למטה מושגת על ידי הפרעה קטנה (si) RNA, אשר בדרך כלל נמשך 5-7 ימים לאחר החצייה, והוא מושפע היתרון השני של הפרוטוקול כפי שמתואר כאן הוא הדור המהיר יחסית של אצוות של C2C12 להוריד תאים באמצעות puromycin הבחירה. חלופות, כגון CRISPR/Cas9-בתיווך גנים בנוקאאוט או בידוד של תא ראשי שריר השלד מראש מפני האדם או היעד-גנים לקויה לקוי הם מבחינה טכנית יותר מאתגרת או דורשים את הזמינות של ביופסיות שרירים החולה או היעד-עכברים לקוי המטרה, בהתאמה. עם זאת, דומה לגישות אחרות של תרבות התא, יש מגבלות בשימוש בתאי C2C12 כמודל לבידול תא שריר השלד, כגון הטבע דו מימדי (2D) של הגדרת תרבות התא ואת העדר בסביבה vivo מיקרו כי הוא קריטי לשמור על תאים מובחן שריר השלד מקודמן10.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מתארים כאן פרוטוקול עבור הנוק יציב של חלבונים ECM ב C2C12 myoblasts חזיק ולניתוח פנוטימית של הבידול של C2C12 myoblasts חזיק לתוך מיוכי. מספר גורמים קובעים את תוצאת הניסוי וצריכים להיחשב בזהירות. שמירה על תאים C2C12 בשלב מתרבים הוא צעד קריטי כדי לשמור את התאים C2C12 במצב הקודמי במחוז myoblast. שמירה על היכולת של…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ד. ד. נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (המכון הלאומי לדלקת פרקים והשלד ומחלות עור, niams, גרנט מספר AR070748) ומימון זרעים מלני & פיטר W. מיי המחלקה לאורטופדיה, icahn הספר לרפואה ב הר סיני.
Materials
| Acetone | Fisher Chemical | 191784 | |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423 | |
| Ampicillin | Fisher Bioreagents | BP1760-5 | |
| Automated cell counter Countesse II | Invitrogen | A27977 | |
| Bradford Reagent | Thermo Scientific | P4205987 | |
| C2C12 cells | ATCC | CRL-1772 | |
| Chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Chloroform | Fisher Chemical | 183172 | |
| DMEM | GIBCO | 11965-092 | |
| DMSO | Fisher Bioreagents | BP231-100 | |
| DNase I (Amplification Grade) | Invitrogen | 18068015 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 97068-085 | |
| GAPDH | EMD Millipore | MAB374 | |
| Glycine | VWR Life Sciences | 19C2656013 | |
| Goat-anti-mouse secondary antibody (IRDYE 800CW) | Li-Cor | C90130-02 | |
| Goat-anti mouse secondary antibody (Rhodamine-red) | Jackson Immune Research | 133389 | |
| HCl | Fisher Chemical | A144S | |
| Incubator (Shaker) | Denville Scientific Corporation | 1704N205BC105 | |
| Mercaptoethanol | Amresco, VWR Life Sciences | 2707C122 | |
| Midiprep plasmid extraction kit | Qiagen | 12643 | |
| Myosin 4 (myosin heavy chain) | Invitrogen | 14-6503-82 | |
| Mounting medium | Invitrogen | 2086310 | |
| NaCl | VWR Life Sciences | 241 | |
| non-ionic surfactant/detergent | VWR Life Sciences | 18D1856500 | |
| Paraformaldehyde | MP | 199983 | |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP399-4 | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Penicillin/streptomycin antibiotics | GIBCO | 15140-122 | |
| Petridishes | Corning | 353003 | |
| Polypropylene tubes | Fisherbrand | 149569C | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 33576300 | |
| Puromycin | Fisher Scientific | BP2956100 | |
| PCR (Real Time) | Applied Biosystems | 4359284 | |
| Reaction tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| Reverse Transcription Master Mix | Applied Biosystems | 4368814 | |
| RIPA buffer | Thermo Scientific | TK274910 | |
| sh control plasmid | Sigma-Aldrich | 07201820MN | |
| sh 3086 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092578 | |
| sh 972 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092579 | |
| sh 1977 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092582 | |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Scientific | NanoDrop One C | |
| SYBR Green Reagent Master Mix | Applied Biosystems | 743566 | |
| Trichloroacetic acid | Acros Organics | 30145369 | |
| Trizol reagent | Ambion | 254707 | |
| Trypan blue | GIBCO | 15250-061 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | BP1421 | |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco-Life Technology Corporation | 2085459 | |
| Water (DEPC treated and nuclease free) | Fisher Bioreagents | 186163 | |
| Western blotting apparatus | Biorad | Mini Protean Tetra Cell | |
| Yeast extract | Fisher Bioreagents | BP1422 |
References
- Tanzer, M. L. Current concepts of extracellular matrix. Journal of Orthopaedic Science: Official Journal of the Japanese Orthopaedic Association. 11 (3), 326-331 (2006).
- Hubmacher, D., Apte, S. S. The biology of the extracellular matrix: novel insights. Current Opinion in Rheumatology. 25 (1), 65-70 (2013).
- Sakai, L. Y., Keene, D. R. Fibrillin protein pleiotropy: Acromelic dysplasias. Matrix Biology. 80, 6-13 (2019).
- Iozzo, R. V., Gubbiotti, M. A. Extracellular matrix: The driving force of mammalian diseases. Matrix Biology. 71-72, 1-9 (2018).
- Le Goff, C., et al. ADAMTSL2 mutations in geleophysic dysplasia demonstrate a role for ADAMTS-like proteins in TGF-beta bioavailability regulation. Nature Genetics. 40 (9), 1119-1123 (2008).
- Dubail, J., Apte, S. S. Insights on ADAMTS proteases and ADAMTS-like proteins from mammalian genetics. Matrix Biology. 44-46, 24-37 (2015).
- Koo, B. H., et al. ADAMTS-like 2 (ADAMTSL2) is a secreted glycoprotein that is widely expressed during mouse embryogenesis and is regulated during skeletal myogenesis. Matrix Biology. 26 (6), 431-441 (2007).
- Khodabukus, A., Baar, K. The effect of serum origin on tissue engineered skeletal muscle function. Journal of Cellular Biochemistry. 115 (12), 2198-2207 (2014).
- Bajaj, P., et al. Patterning the differentiation of C2C12 skeletal myoblasts. Integrative Biology. 3 (9), 897-909 (2011).
- Mashinchian, O., Pisconti, A., Le Moal, E., Bentzinger, C. F. The Muscle Stem Cell Niche in Health and Disease. Current Topics in Developmental Biology. 126, 23-65 (2018).
- Hindi, L., McMillan, J. D., Afroze, D., Hindi, S. M., Kumar, A. Isolation, Culturing, and Differentiation of Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult Mice. Bio-protocol. 7 (9), 2248 (2017).
- Krauss, R. S., Joseph, G. A., Goel, A. J. Keep Your Friends Close: Cell-Cell Contact and Skeletal Myogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (2), 029298 (2017).
- Lawson, M. A., Purslow, P. P. Differentiation of myoblasts in serum-free media: effects of modified media are cell line-specific. Cells Tissues Organs. 167 (2-3), 130-137 (2000).
- Fujita, H., Endo, A., Shimizu, K., Nagamori, E. Evaluation of serum-free differentiation conditions for C2C12 myoblast cells assessed as to active tension generation capability. Biotechnology and Bioengineering. 107 (5), 894-901 (2010).
- Cheng, C. S., et al. Conditions that promote primary human skeletal myoblast culture and muscle differentiation in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), 385-395 (2014).
- Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities. Journal of Cellular Physiology. 186 (1), 82-94 (2001).
- Dodds, E., Dunckley, M. G., Naujoks, K., Michaelis, U., Dickson, G. Lipofection of cultured mouse muscle cells: a direct comparison of Lipofectamine and DOSPER. Gene Therapy. 5 (4), 542-551 (1998).
- Balcı, B., Dinçer, P. Efficient transfection of mouse-derived C2C12 myoblasts using a matrigel basement membrane matrix. Biotechnology Journal. 4 (7), 1042-1045 (2009).
- Xia, D., et al. Overexpression of chemokine-like factor 2 promotes the proliferation and survival of C2C12 skeletal muscle cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1591 (1), 163-173 (2002).
- Tapia, O., Gerace, L. Analysis of Nuclear Lamina Proteins in Myoblast Differentiation by Functional Complementation. Methods in Molecular Biology. 1411, 177-194 (2016).
- Yamano, S., Dai, J., Moursi, A. M. Comparison of transfection efficiency of nonviral gene transfer reagents. Molecular Biotechnology. 46 (3), 287-300 (2010).
- Luo, J., et al. An efficient method for in vitro gene delivery via regulation of cellular endocytosis pathway. International Journal of Nanomedicine. 10, 1667-1678 (2015).
- Sandri, M., Bortoloso, E., Nori, A., Volpe, P. Electrotransfer in differentiated myotubes: a novel, efficient procedure for functional gene transfer. Experimental Cell Research. 286 (1), 87-95 (2003).
- Yi, C. E., Bekker, J. M., Miller, G., Hill, K. L., Crosbie, R. H. Specific and potent RNA interference in terminally differentiated myotubes. Journal of Biological Chemistry. 278 (2), 934-939 (2003).
- Antolik, C., De Deyne, P. G., Bloch, R. J. Biolistic transfection of cultured myotubes. Science’s STKE. 2003 (192), 11 (2003).
- Shintaku, J., et al. MyoD Regulates Skeletal Muscle Oxidative Metabolism Cooperatively with Alternative NF-kappaB. Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).
