Summary

Visualização de receptores de estrogênio em cólons de camundongos com doença de Crohn induzida pelo TNBS usando imunofluorescência

Published: March 12, 2020
doi:

Summary

O protocolo apresenta um modelo completo de murina induzida por TNBS da doença de Crohn e métodos para visualização de receptores de estrogênio por imunohistoquímica usando imunofluorescência de seções de cólon fixas de formalina embutidas em parafina.

Abstract

A doença de Crohn é o tipo mais diagnosticado de doença inflamatória intestinal. A inflamação crônica que se desenvolve no intestino leva à desordem da peristalse e aos danos da mucosa intestinal e parece estar associada a um risco aumentado de transformação neoplásica do cólon. O acúmulo de evidências indica que os estrogênios e receptores de estrogênio afetam não apenas tecidos sensíveis a hormônios, mas também outros tecidos não diretamente relacionados a estrogênios, como os pulmões ou cólon. Aqui, descrevemos o protocolo para a bem sucedida coloração de imunofluorescência de receptores de estrogênio no cólon obtido susceptência de um modelo murina da doença de Crohn induzida pelo TNBS. Um protocolo detalhado para a indução da doença de Crohn em camundongos e preparação do intestino é fornecido, bem como um procedimento imunohistoquímico passo a passo usando seções de intestino parafina fixado formalina. Os métodos descritos não só são úteis para a detecção de receptores de estrogênio e a investigação de sinalização de estrogênio in vivo, mas também podem ser aplicados para outras proteínas que podem estar envolvidas no desenvolvimento de colite.

Introduction

A doença de Crohn (CD) é uma doença inflamatória intestinal (DII) manifestada como inflamação crônica do intestino. A etiologia do CD é pouco compreendida, mas existem alguns fatores importantes que parecem ser responsáveis pelo desenvolvimento do CD, incluindo a microbiota intestinal, e fatores genéticos e ambientais, como dieta ou estresse1. Para uma melhor compreensão da patogênese da doença de Crohn, vários modelos de inflamação intestinal têm sido utilizados2,3,4,5,6,7. Neste artigo, apresentamos resultados obtidos a partir de um modelo de murina induzida por 2,4,6-trinitrobbenzeno (TNBS) do modelo de CD.

Foi documentado que os estrogênios são capazes de modular a inflamação intestinal crônica8,,9,10,11,12. A atividade biológica dos estrogênios é mediada por receptores cognatos, entre os quais estão receptores de estrogênio nuclear (ERs), ou seja, ERα (gene ESR1) e ERβ (gene ESR2),bem como receptor esgota do g acoplado à proteína, ou seja, GPER (gene GPER1),referido como ER13,14. Existem vários métodos para determinar o nível dos receptores de estrogênio, mas apenas alguns podem ser usados para visualizá-los no intestino.

A imunohistoquímica (IHC) é um método amplamente utilizado em estudos clínicos e básicos para a detecção de certos antígenos em células ou tecidos com anticorpos florocromos conjugados. O IHC parece ser um importante método na visualização da estrutura tecidual, bem como na identificação e localização de proteínas específicas, o que pode ser crucial para a compreensão do desenvolvimento da colite. Aqui, apresentamos um protocolo completo e validado para visualização imunohistoquímica de receptores de estrogênio no intestino usando imunofluorescência.

Protocol

Os estudos em animais foram realizados com o consentimento do Comitê Deética Local (28/ŁB29/2016) em conformidade com a Diretiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu e do Conselho de 22 de Setembro de 2010, e recomendações institucionais. 1. Modelo de murina induzida pelo TNBS da doença de Crohn NOTA: Este protocolo utiliza camundongos machos BALB/C pesando 25-28 g. Os animais estão alojados a uma temperatura constante (22-24 °C) e, umidade relativa de 55 ± 5%, e…

Representative Results

Características macroscópicas de cólons em camundongos com doença de Crohn induzida pelo TNBSImagens representativas de cólons retirados do controle e camundongos tratados com TNBS são mostradas na Figura 2. Em camundongos com um modelo induzido por TNBS da doença de Crohn, o comprimento do cólon é reduzido enquanto a largura do cólon é aumentada. <img alt="Figure 2" …

Discussion

Existem inúmeros modelos animais para o exame de fisiopatologia do IBD, incluindo modelos genéticos, imunológicos ou espontâneos, bem como modelos quimicamente induzidos15. Entre os vários tipos de modelos animais de colite, modelos quimicamente induzidos, como o modelo induzido pelo TNBS descrito neste protocolo, são relativamente baratos e fáceis de obter. O modelo de murina induzida pelo TNBS tem vários sintomas clínicos relacionados à base patológica do CD. Animais com colite induzi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O trabalho foi publicado graças ao apoio financeiro das autoridades da Universidade de Lodz: Vice-Reitor de Pesquisa Científica, Vice-Reitor de Cooperação Nacional e Internacional e Reitor da Faculdade de Biologia e Proteção Ambiental. Damian Jacenik foi apoiado por subsídios (2017/24/T/NZ5/00045 e 2015/17/N/NZ5/00336) do National Science Centre, Polônia.

Materials

Animals
BALB/C mice University of Lodz NA
Equipment
Caliper VWR 62379-531
Cardboard block NA NA
Confocal microscope – TCS SP8 Leica Biosystems NA
Fully automated rotary microtome – RM2255 Leica Biosystems NA
Glass slide Thermo Scientific J1800BMNT
Heated Paraffin Embedding Module – EG1150 H Leica Biosystems NA
Histological box Marfour LN.138747
Hydrophobic pen Sigma-Aldrich Z377821
Laboratory balance Radwag WL-104-0048
LAS X software Leica Biosystems NA
Metal mold Marfour CP.5105
Sterile gauze NA NA
Sterile scissor NA NA
Sterile tweezer NA NA
Tissue processor – TP1020 Leica Biosystems NA
Reagents
2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid Sigma-Aldrich 92822
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A3294
DiOC6 (3) Sigma-Aldrich 318426
DyLight 650 secondary antibody Abcam ab96886
ERα primary antibody Abcam ab75635
ERβ primary antibody Abcam ab3576
Ethanol Avantor Performance Materials Poland 396480111
Formaldehyde Avantor Performance Materials Poland 432173111
GPER primary antibody Abcam ab39742
Hydrochloric acid Avantor Performance Materials Poland 575283421
Hydrogen peroxidase Avantor Performance Materials Poland 885193111
isoflurane (forane) Baxter 1001936040
Normal goat serum Gibco 16210064
Paraffin Leica Biosystems 39602012
Petrie dish Nest Scientific 705001
Phosphate buffer saline Sigma-Aldrich P3813
Physiological saline Sigma-Aldrich 7982
Primocin (antibiotic) Invitrogen ant-pm-1
ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI) Invitrogen P36971
Sodium chloride Chempur WE/231-598-3
Sodium citrate Avantor Performance Materials Poland 795780429
Tris Avantor Performance Materials Poland 853470115
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
Xylene Avantor Performance Materials Poland BA0860119

References

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Cite This Article
Jacenik, D., Zielińska, M., Michlewska, S., Fichna, J., Krajewska, W. M. Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn’s Disease using Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (157), e60813, doi:10.3791/60813 (2020).

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