Summary

Visualización de receptores de estrógeno en colones de ratones con enfermedad de Crohn inducida por TNBS utilizando inmunofluorescencia

Published: March 12, 2020
doi:

Summary

El protocolo presenta un modelo murino completo validado inducido por TNBS de la enfermedad de Crohn y métodos para la visualización de receptores de estrógeno por inmunohistoquímica utilizando inmunofluorescencia de secciones de colon fijas en formalina incrustadas en parafina.

Abstract

La enfermedad de Crohn es el tipo más diagnosticado de enfermedad inflamatoria intestinal. La inflamación crónica que se desarrolla en el intestino conduce al trastorno de peristalsis y al daño de la mucosa intestinal y parece estar asociada con un mayor riesgo de transformación neoplásica del colon. La evidencia acumulada indica que los estrógenos y los receptores de estrógenos afectan no sólo los tejidos sensibles a las hormonas, sino también otros tejidos no directamente relacionados con los estrógenos, como los pulmones o el colon. Aquí, describimos el protocolo para la correcta tinción de inmunofluorescencia de receptores de estrógeno en el colon obtenido de un modelo murino de la enfermedad de Crohn inducida por TNBS. Se proporciona un protocolo detallado para la inducción de la enfermedad de Crohn en ratones y la preparación intestinal, así como un procedimiento inmunohistoquímico paso a paso utilizando secciones intestinales fijas en parafina fijas en formalina. Los métodos descritos no sólo son útiles para la detección de receptores de estrógeno y la investigación de señalización de estrógeno in vivo, sino que también se pueden aplicar a otras proteínas que pueden estar implicadas en el desarrollo de la colitis.

Introduction

La enfermedad de Crohn (CD) es una enfermedad inflamatoria intestinal (EII) que se manifiesta como inflamación del intestino crónico. La etiología de la CD no se entiende bien, pero hay algunos factores importantes que parecen ser responsables del desarrollo de la CD, incluida la microbiota intestinal, y los factores genéticos y ambientales, como la dieta o el estrés1. Para una mejor comprensión de la patogénesis de la enfermedad de Crohn, se han utilizado varios modelos de inflamación intestinal2,3,4,5,6,7. En este artículo, presentamos resultados obtenidos de un modelo murino inducido por ácido sulfónico (TNBS) de 2,4,6-trinitrobenzeno(TNBS) de CD.

Se ha documentado que los estrógenos son capaces de modular la inflamación intestinal crónica8,9,10,11,12. La actividad biológica de los estrógenos está mediada por receptores cognados, entre los que se encuentran los receptores de estrógeno nuclear (ER), es decir, eRE (gen ESR1)y ER ( gen ESR2), así como el receptor de estrógeno acoplado a proteínas G, es decir, GPER (gen GPER1),denominado ER13,,14. Hay varios métodos para determinar el nivel de receptores de estrógeno, pero sólo unos pocos se pueden utilizar para visualizarlos en el intestino.

La inmunohistoquímica (IHC) es un método ampliamente utilizado en estudios clínicos y básicos para la detección de ciertos antígenos en células o tejidos con anticuerpos conjugados con fluorocromo. IHC parece ser un método importante en la visualización de la estructura tisular, así como en la identificación y localización de proteínas específicas, que pueden ser cruciales para entender el desarrollo de la colitis. Aquí, presentamos un protocolo completo y validado para la visualización inmunohistoquímica de receptores de estrógeno en el intestino utilizando inmunofluorescencia.

Protocol

Los estudios en animales se llevaron a cabo con el consentimiento del Comité ético local (28/B29/2016) de conformidad con la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de septiembre de 2010, y las recomendaciones institucionales. 1. Modelo murino inducido por TNBS de la enfermedad de Crohn NOTA: Este protocolo utiliza ratones macho sABA/C con un peso de 25-28 g. Los animales se alojan a una temperatura constante (22-24 oC) y, humedad relativa d…

Representative Results

Características macroscópicas de los colones en ratones con enfermedad de Crohn inducida por TNBSEn la Figura 2se muestran imágenes representativas de colones tomados del control y ratones tratados con TNBS. En ratones con un modelo inducido por TNBS de la enfermedad de Crohn, la longitud del colon se reduce mientras aumenta el ancho del colon. <img alt="Figure 2" class="xfig…

Discussion

Existen numerosos modelos animales para el examen de la fisiopatología de la EII, incluidos los modelos genéticos, inmunológicos o espontáneos, así como los modelos15inducidos químicamente. Entre los varios tipos de modelos animales de colitis, los modelos inducidos químicamente como el modelo inducido por TNBS descrito en este protocolo, son relativamente baratos y fáciles de obtener. El modelo murino inducido por TNBS de la colitis tiene varios síntomas clínicos relacionados con la bas…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El trabajo fue publicado gracias al apoyo financiero de las autoridades de la Universidad de Lodz: Vicerrector de Investigación Científica, Vicerrector de Cooperación Nacional e Internacional y dedean de la Facultad de Biología y Protección Ambiental. Damian Jacenik fue apoyado por subvenciones (2017/24/T/NZ5/00045 y 2015/17/N/NZ5/00336) del Centro Nacional de Ciencias, Polonia.

Materials

Animals
BALB/C mice University of Lodz NA
Equipment
Caliper VWR 62379-531
Cardboard block NA NA
Confocal microscope – TCS SP8 Leica Biosystems NA
Fully automated rotary microtome – RM2255 Leica Biosystems NA
Glass slide Thermo Scientific J1800BMNT
Heated Paraffin Embedding Module – EG1150 H Leica Biosystems NA
Histological box Marfour LN.138747
Hydrophobic pen Sigma-Aldrich Z377821
Laboratory balance Radwag WL-104-0048
LAS X software Leica Biosystems NA
Metal mold Marfour CP.5105
Sterile gauze NA NA
Sterile scissor NA NA
Sterile tweezer NA NA
Tissue processor – TP1020 Leica Biosystems NA
Reagents
2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid Sigma-Aldrich 92822
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A3294
DiOC6 (3) Sigma-Aldrich 318426
DyLight 650 secondary antibody Abcam ab96886
ERα primary antibody Abcam ab75635
ERβ primary antibody Abcam ab3576
Ethanol Avantor Performance Materials Poland 396480111
Formaldehyde Avantor Performance Materials Poland 432173111
GPER primary antibody Abcam ab39742
Hydrochloric acid Avantor Performance Materials Poland 575283421
Hydrogen peroxidase Avantor Performance Materials Poland 885193111
isoflurane (forane) Baxter 1001936040
Normal goat serum Gibco 16210064
Paraffin Leica Biosystems 39602012
Petrie dish Nest Scientific 705001
Phosphate buffer saline Sigma-Aldrich P3813
Physiological saline Sigma-Aldrich 7982
Primocin (antibiotic) Invitrogen ant-pm-1
ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI) Invitrogen P36971
Sodium chloride Chempur WE/231-598-3
Sodium citrate Avantor Performance Materials Poland 795780429
Tris Avantor Performance Materials Poland 853470115
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
Xylene Avantor Performance Materials Poland BA0860119

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Cite This Article
Jacenik, D., Zielińska, M., Michlewska, S., Fichna, J., Krajewska, W. M. Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn’s Disease using Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (157), e60813, doi:10.3791/60813 (2020).

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