Summary

تصور مستقبلات هرمون الاستروجين في كولونات الفئران مع مرض كرون TNBS الناجم ة باستخدام الفلورسينالمناعي

Published: March 12, 2020
doi:

Summary

يقدم البروتوكول نموذج ًا كاملًا من المورين الناجم عن TNBS من مرض كرون وطرق تصور مستقبلات الإستروجين بواسطة الكيمياء المناعية باستخدام الفلورات المناعية لأقسام القولون الثابتة من formalin المضمنة في البارافين.

Abstract

مرض كرون هو النوع الأكثر تشخيصا من مرض التهاب الأمعاء. التهاب مزمن النامية في الأمعاء يؤدي إلى اضطراب التمعم وتلف الغشاء المخاطي المعوي ويبدو أن يرتبط مع زيادة خطر التحول النيوبلاستيك القولون. تشير الأدلة المتراكمة إلى أن هرمون الاستروجين ومستقبلات الإستروجين لا تؤثر فقط على الأنسجة الحساسة للهرمون ، ولكن أيضًا على الأنسجة الأخرى التي لا ترتبط مباشرة بهرمون الاستروجين ، مثل الرئتين أو القولون. هنا، ونحن نصف بروتوكول لتلطيخ الفلور المناعي الناجح لمستقبلات هرمون الاستروجين في القولون التي تم الحصول عليها من نموذج مورين من مرض كرون الناجم عن TNBS. يتم توفير بروتوكول مفصل لتحريض مرض كرون في إعداد الفئران والأمعاء بالإضافة إلى إجراء مناعي خطوة بخطوة باستخدام أقسام الأمعاء المضمنة بالبارافين الثابتة. الأساليب الموصوفة ليست مفيدة فقط للكشف عن مستقبلات هرمون الاستروجين والاستروجين إشارة التحقيق في الجسم الحي ولكن يمكن أيضا أن تطبق على للبروتينات الأخرى التي قد تشارك في تطوير التهاب القولون.

Introduction

مرض كرون (CD) هو مرض التهاب الأمعاء (IBD) يتجلى التهاب الأمعاء المزمن. لا يفهم مسببات CD بشكل جيد ، ولكن هناك عدد قليل من العوامل الرئيسية التي يبدو أنها مسؤولة عن تطوير CD ، بما في ذلك ميكروبيوتا الأمعاء ، والعوامل الوراثية والبيئية ، مثل النظام الغذائي أو الإجهاد1. من أجل فهم أفضل لإمراض مرض كرون ، تم استخدام عدة نماذج من التهاب الأمعاء2،3،4،5،66،7., في هذه المقالة، نقدم النتائج التي تم الحصول عليها من 2,4,6-trinitrobenzene حمض السلفوين (TNBS) الناجمة عن نموذج المورين من CD.

وقد تم توثيق أن هرمون الاستروجين قادرة على تحوير التهاب الأمعاء المزمن8،9،10،11،12. النشاط البيولوجي لهرمون الاستروجين بوساطة مستقبلات الكونات ، من بينها مستقبلات الإستروجين النووية (ERs) ، أي ERα (جين ESR1)و ERα (جين ESR2)، وكذلك مستقبلات الإستروجين المقترنة بالبروتين G ، أي GPER (جين GPER1)، يشار إليها باسم ER13،14. هناك عدة طرق لتحديد مستوى مستقبلات هرمون الاستروجين، ولكن يمكن استخدام عدد قليل فقط لتصور لهم في الأمعاء.

الكيمياء المناعية (IHC) هي طريقة تستخدم على نطاق واسع في الدراسات السريرية والأساسية للكشف عن بعض المستضدات في الخلايا أو الأنسجة مع الأجسام المضادة المترافقة الفلوروكروم. يبدو أن الـ IHC طريقة مهمة في تصور بنية الأنسجة ، وكذلك في تحديد وتوطين بروتينات محددة ، والتي قد تكون حاسمة لفهم تطور التهاب القولون. هنا ، نقدم بروتوكولًا كاملًا ومصدقًا عليه للتصور المناعي الكيميائي لمستقبلات هرمون الاستروجين في الأمعاء باستخدام الفلورسينس المناعي.

Protocol

أجريت الدراسات على الحيوانات بموافقة اللجنة الأخلاقية المحلية (28/ŁB29/2016) وفقًا للتوجيه 2010/63/EU الصادر عن البرلمان الأوروبي ومجلس 22 سبتمبر 2010 والتوصيات المؤسسية. 1. TNBS الناجمة عن نموذج مورين من مرض كرون ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول ذكور BALB/ C الفئران وزنها 25-28 غرا?…

Representative Results

خصائص تنظير القولون في الفئران مع مرض كرون الناجم عن TNBSتظهر الصور التمثيلية للنقطتين المأخوذة من التحكم والفئران المعالجة من TNBS في الشكل 2. في الفئران التي لديها نموذج TNBS الناجم عن مرض كرون ، يتم تقليل طول القولون بينما يتم زيادة عرض القولون….

Discussion

هناك العديد من النماذج الحيوانية لفحص الفيزيولوجيا المرضية IBD ، بما في ذلك النماذج الوراثية أو المناعية أو العفوية ، وكذلك النماذج المستحثة كيميائيًا15. ومن بين عدة أنواع من النماذج الحيوانية من التهاب القولون، النماذج المستحثة كيميائيا مثل النموذج الناجم عن TNBS الموصوفة في ه…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد نُشر العمل بفضل الدعم المالي الذي تقدمه سلطات جامعة لودز: نائب رئيس الجامعة للبحث العلمي، ونائب رئيس الجامعة للتعاون الوطني والدولي، وعميد كلية البيولوجيا وحماية البيئة. تم دعم داميان جاسينك بمنح (2017/24/T/NZ5/00045 و 2015/17/N/NZ5/NZ5/00336) من المركز الوطني للعلوم، بولندا.

Materials

Animals
BALB/C mice University of Lodz NA
Equipment
Caliper VWR 62379-531
Cardboard block NA NA
Confocal microscope – TCS SP8 Leica Biosystems NA
Fully automated rotary microtome – RM2255 Leica Biosystems NA
Glass slide Thermo Scientific J1800BMNT
Heated Paraffin Embedding Module – EG1150 H Leica Biosystems NA
Histological box Marfour LN.138747
Hydrophobic pen Sigma-Aldrich Z377821
Laboratory balance Radwag WL-104-0048
LAS X software Leica Biosystems NA
Metal mold Marfour CP.5105
Sterile gauze NA NA
Sterile scissor NA NA
Sterile tweezer NA NA
Tissue processor – TP1020 Leica Biosystems NA
Reagents
2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid Sigma-Aldrich 92822
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A3294
DiOC6 (3) Sigma-Aldrich 318426
DyLight 650 secondary antibody Abcam ab96886
ERα primary antibody Abcam ab75635
ERβ primary antibody Abcam ab3576
Ethanol Avantor Performance Materials Poland 396480111
Formaldehyde Avantor Performance Materials Poland 432173111
GPER primary antibody Abcam ab39742
Hydrochloric acid Avantor Performance Materials Poland 575283421
Hydrogen peroxidase Avantor Performance Materials Poland 885193111
isoflurane (forane) Baxter 1001936040
Normal goat serum Gibco 16210064
Paraffin Leica Biosystems 39602012
Petrie dish Nest Scientific 705001
Phosphate buffer saline Sigma-Aldrich P3813
Physiological saline Sigma-Aldrich 7982
Primocin (antibiotic) Invitrogen ant-pm-1
ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI) Invitrogen P36971
Sodium chloride Chempur WE/231-598-3
Sodium citrate Avantor Performance Materials Poland 795780429
Tris Avantor Performance Materials Poland 853470115
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
Xylene Avantor Performance Materials Poland BA0860119

References

  1. Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. Inflammatory bowel disease: pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).
  2. Morris, G. P., et al. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
  3. Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
  4. Boirivant, M., Fuss, I. J., Chu, A., Strober, W. Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4. Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1929-1939 (1998).
  5. Morrissey, P. J., Charrier, K., Braddy, S., Liggitt, D., Watson, J. D. CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).
  6. Kühn, R., Löhler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., Müller, W. Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis. Cell. 75 (2), 263-274 (1993).
  7. Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice. Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).
  8. Harnish, D. C., et al. Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).
  9. Pierdominici, M., et al. Linking estrogen receptor β expression with inflammatory bowel disease activity. Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).
  10. Włodarczyk, M., et al. G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study. Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).
  11. Mohammad, I., et al. Estrogen receptor α contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation. Science Signaling. 11 (526), eaap9415 (2018).
  12. Jacenik, D., et al. G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn’s disease. Scientific Reports. 9 (1), 6749 (2019).
  13. Prossnitz, E. R., Barton, M. The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease. Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).
  14. Yaşar, P., Ayaz, G., User, S. D., Güpür, G., Muyan, M. Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling. Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).
  15. Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. Mouse models for the study of Crohn’s disease. Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).
  16. Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., Stüber, E., Strober, W. Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice. Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).
  17. Ikeda, M., et al. Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis. Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).
  18. Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).

Play Video

Cite This Article
Jacenik, D., Zielińska, M., Michlewska, S., Fichna, J., Krajewska, W. M. Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn’s Disease using Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (157), e60813, doi:10.3791/60813 (2020).

View Video