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Medicine

バイオマーカー分析のための臨床試験サイトにおける単一の血液引き出しからの末梢血単核細胞ペレットと血漿の調製

Published: March 20, 2021
doi:
10.3791/60776
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1Translational Medicine, R&D Oncology,AstraZeneca, 2Acerta Pharma, AstraZeneca Group, 3Translational Medicine, R&D Oncology,AstraZeneca

Summary

このプロトコルは、翻訳バイオマーカー分析に使用できる臨床試験サイトでの高品質PBMCおよび血漿バイオサンプルの臨床実施可能な調製を詳述する。

Abstract

末梢血におけるバイオマーカーの分析は、治療効果を評価するメカニズムの証明を確立し、治療の用量およびスケジュール設定を導くために臨床試験でますます重要になってきています。単一の血液の引き出しから、末梢血単核細胞を単離して処理してタンパク質マーカーを分析および定量することができ、そして血漿サンプルは循環腫瘍DNA、サイトカインおよび血漿メタボロミクスの分析に使用することができる。治療からの縦方向サンプルは、所定のタンパク質マーカーの進化、患者の変異状態および免疫学的景観に関する情報を提供する。これは、末梢血の処理が臨床現場で効果的に行われ、サンプルがベッドサイドからベンチに適切に保存されている場合にのみ達成できる。ここでは、多施設臨床試験でPBMCペレットやプラズマサンプルを得るための臨床現場で実装できる最適化された汎用プロトコルを提示し、病院の臨床専門家は技術的専門知識のレベルに関係なく、高品質のサンプルを正常に提供できるようにします。より具体的なダウンストリーム分析方法に最適化された代替プロトコルのバリエーションも提示されています。このプロトコルは、X線照射血液上のDNA損傷応答(DDR)に対するタンパク質バイオマーカーを研究し、DDR薬および/または放射線療法が実施されている腫瘍学の設定および機械学的仮説検査が必要な前臨床段階におけるアプローチの適合性を実証するために適用する。

Introduction

医薬品開発は、満たされていない医療ニーズとよりターゲットを絞ったパーソナライズされた医療に対処する新しい治療法を提供することを目指しています。キナーゼ1、プロテアーゼ2、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(PARP)阻害剤3、タンパク質分解剤4、治療抗体5、抗体共役薬(APC)6などの酵素阻害を含む複数の薬物メカニズムが積極的に検討されている。腫瘍学においてより良い治療法を得るための取り組みの一例は、癌細胞の増殖を1,7に保つシグナル伝達カスケードを停止することを目的としたキナーゼ阻害剤の使用である。これらのキナーゼに特異的な基質リン酸化のレベルを測定することは、これらの阻害剤8の作用機序を定量する最良の薬物力学的バイオマーカーである。他の薬物は、所定のタンパク質の発現を調節する可能性があり、その場合、治療の過程を通じてそれらの標的タンパク質の濃度の変化を縦方向に定量化できることが最も重要である。したがって、薬物または病理の特性とは無関係に、薬物被曝と標的変調との薬物動態(PK)/薬力学(PD)関係を確立するためのバイオマーカーの評価は、早期臨床開発におけるベストプラクティスであり、安全で許容可能な薬理学的活性用量/スケジュール9の決定を可能にする。

腫瘍学の臨床開発では、バイオマーカー分析は、薬物のメカニズムの証明を確立するための最良の設定かもしれないが、試験で利用可能な生検の数は、通常、10,11にかなり限られている。あるいは、末梢血サンプルは、低侵襲的処置を伴い、迅速かつ容易に縦方向分析を得ることができ、生検よりも安価であり、治療結果のリアルタイムモニタリングのための膨大な情報を提供するため、臨床試験にとって非常に価値がある。末梢血におけるPDバイオマーカーを評価する付加的な利点は、PK/PD定量的関係を決定する際に正確性を可能にするPKを定量化するために生体試料を使用する能力と、その後のPK/PDモデリング12,13である。全血からの末梢血単核細胞(PBMCs)を単離して、発現レベルの変化または翻訳後の修飾のいずれかを経験するタンパク質マーカーを研究することができる。さらに、PBMCsは免疫フェノタイピング目的で使用することができ、14,15、RNA単離を介した抗体依存性細胞傷害性(ADCC)16およびエピジェネティック解析の評価などの免疫機能性アッセイ。同様に、全血からの血漿は、サイトカインを定量化して患者の免疫応答を特徴付け、代謝研究を行い、また治療剤から選択された疾患のクローン進化をモニタリングするための循環腫瘍DNA(ctDNA)を単離および配列的に、頻繁に治療抵抗17、18、19の治療抵抗の後の世代の発達を可能にする。最後に、末梢血からの循環腫瘍細胞(CTC)の単離は、縦列挙、DNA/RNAシーケンシングおよびタンパク質バイオマーカー分析21による疾患進行の評価を可能にする。この単離は本明細書22に記載されたプロトコルと互換性があるが、多くの癌タイプおよび疾患の初期段階におけるCTCの豊富さの低さは、CTC分解23を最小限に抑えるためにより適した特殊なチューブの使用を作る。

近年、液体生検の使用は、臨床試験で得られた情報を改善し、PBMCコレクションは、いくつかのタイプの造食癌細胞の腫瘍細胞に直接、または腫瘍細胞24、25、26のPDサロゲートとしてPBMCs自体に直接、標的関与およびメカニズムの証明を監視するために多くの研究に含まれている。高品質のサンプルの調製は、特定の病理に対する最も安全で最も効果的な治療法を決定することにプラスの影響を与えますが、我々の経験では、異なる臨床現場から得られるPBMC製剤の品質は、下流分析の目的に合わないサンプルを生じる品質の広い変動を受けています。これは、これらの研究から収集できるPDデータの量に影響を与えました。

ここでは、臨床環境で単一の血液ドローからPBMCsと血漿サンプルの両方を効率的に分離する方法を示す、簡単に従うプロトコルについて詳しく説明します。このプロトコルは、単核細胞調製チューブの製造業者が提供する指示に基づいており、遠心分離の問題、処理遅延、凍結へのサンプル転送など、臨床現場で報告されたプロトコル実行の困難を現実世界の経験が強調した変更を組み込んでいます。血液27から溶液を分離する障壁の有無にかかわらず、多糖溶液を用いた密度勾配分離に基づく単核細胞調製管の使用に対する代替の商業的に入手可能な方法がある。関連する臨床サイトがこれらの代替方法論で既に十分に経験されている場合、このプロトコルは、これらに置換することができます。このような場合、いくつかの代替方法は、収集チューブからヒト一次生物学的物質の追加の移動がわずかに増加する可能性のある別の調製管への全血の移動を必要とし、多糖溶液から血液を分離する障壁のない方法の成功は、血液サンプルを高密度勾配培地に重ね合わせたなどの重要なステップに依存する。上記の点にもかかわらず、全体的な生存率と細胞回復は、これらの技術15、28の間で比較可能である。したがって、方法論の選択は、以前の技術的経験に多少依存しますが、私たちの手の中では、単核細胞調製チューブは、広範な臨床文脈でうまく使用することができ、そうでなければ、推奨されています。

このプロトコルの1つのエンドポイントは、さらなるリセートに処理するためのPBMCペレットを生成することですが、核酸の単離や、免疫検査(IHC)法に適したPBMCスミアまたはPBMCブロックの製造など、PBMCコレクションの他の最終的なアプリケーションを実装することができます。重要なことに、患者から採取された各バイオサンプルは少なくともある程度の侵襲的処置を表すため、このプロトコルは、サイトカイン分析、メタボロミック研究またはctDNAシーケンシングに使用できる血漿を単離することによって、各サンプルから有用な材料を最大化する。

腫瘍学的試験における末梢バイオマーカーの分析は、PBMCライセートの多くの用途の1つです。一例としては、化学療法、放射線療法、またはホスファチジルイノシトール-3キナーゼ関連キナーゼ(PIKK)7およびPARP関連キナーゼ(PIKK)3、13などのDDRに関与する酵素の阻害剤の使用におけるDNA損傷応答(DDR)の評価である。これらの治療法の目的は、増殖細胞におけるDNA損傷を増大させることであり、これはDDR機構の障害を有する細胞および癌細胞のような細胞周期チェックポイントを有する細胞において高い毒性を生み出す。ここでは、X線を受けた末梢血中のDDRバイオマーカーの研究を例に紹介する。

Protocol

患者の同意および関連する国家倫理要件の完全な遵守(例えば、ヒト組織法(HTA –英国、2004)および健康保険の携帯性と説明責任に関する法律(HIPAA –米国、1996)は必須です。人間由来の資料に関する作業を開始する前に、倫理の承認を完全に文書化してください。このプロトコルの最適化に使用される血液は、国立衛生研究所(NIHR)ケンブリッジ生物医学研究センター(NIHR)との生物サンプル供給契約の下で、NIHRケンブリッジ臨床研究施設(英国ケンブリッジ)が運営するボランティア進める医学パネル(VAMP)(倫理参照16/EE/0459、研究CRF494、サブ研究001)からの適切な同意を得て提供されました。英国のアストラゼネカバイオバンクは、人間組織局(ライセンス番号12109)によってライセンスされ、研究組織銀行(RTB)として国家研究倫理サービス委員会(NREC)承認を受けています(REC No 17/NW/0207)。 1. 一般的な準備ガイダンス 注:このプロトコルの血液、血漿、PBMCなどの未固定のヒト材料を使用するすべての作業は、これらの物質が潜在的に感染性の薬剤を運ぶ可能性があり、適切な生体安全上の予防措置の下で実行されなければならないという仮定の下で動作する必要があります。既知の病原体に対して陰性として検査された患者の場合、サンプルが非感染性であると仮定しないでください。これらの材料から生成された廃棄物は、同じバイオセーフティの予防措置で処理し、現地の規則に従って処分する必要があります。 クエン酸ナトリウムまたはヘパリンナトリウムのいずれかを抗凝固剤として利用する2種類の単核細胞調製管から選択してください。多くの下流のアプリケーションでは、これらの2つの抗凝固剤は同じ意味で使用することができますが、両方の抗凝固剤は、試験のために1つを選択する前にテストする必要があります。 患者のコード化されたIDで採血に使用する1つの8 mL単核細胞調製管にラベルを付け、チューブを室温(18〜25°C)に保ちます。 PBS 1xを室温(18~25°C)で保存してください。準備ごとに30 mLを使用してください。 ラボマニュアルの該当するセクションで指定されているように、個別のプラズマサンプル用のチューブとPBMCサンプル用のクライオビアルが一意の識別子で正確にラベル付けされていることを確認してください。 PBMCを使用してリン酸化タンパク質をモニタリングする場合は、ホスファターゼ阻害剤を補ったPBSを調製する:5mLのホスファターゼ阻害剤カクテル2+ 50μLのホスファターゼ阻害剤カクテル3を50μL混合する。新鮮な準備をし、使用するまで氷の上に保ちます。 PBMCが凍結保存される場合は、90S + 10%DMSOを混合して、サンプルあたり1mLの凍結混合物を調製します。 2. PBMCコレクション (図1A) 製造者が説明する標準的な技術を用いて、8 mLの血液を単核細胞調製管に引き込みます。チューブを8~10回そっと反転させ、抗凝固剤添加剤と血液を混ぜ合わせます。激しくしまわないように振る。血液が引かれた時間を記録します。 回収後、チューブを遠心まで室温で直立して保管します。できるだけ早くサンプルを処理します, 理想的には、この採血の1時間以内に、遅く 4 時間ポストコレクション.血液の処理を開始するタイミングを記録します。 遠心分離の直前に、チューブを8〜10回緩やかに反転させることで血液サンプルをリミックスする。 チューブ/血液サンプルチューブを水平ローター(スイングアウトヘッド)の1,500 ~1,800 x g( 室温(18~25°C)で30分間遠心します。すべてのチューブのバランスが適切であることを確認します。 図1:遠心分離機のプロトコルおよび代表的な画像の一般的な概要。(A) PBMCとプラズマの製造プロトコルの概略図。*時間制約がある場合は、ステップ2.4を20分に短縮し、ステップ3.3~3.6を削除することができます。** 必要に応じて、アリコートを使用してセルをカウントします。ctDNA分析/メタボロミクス(B)のステップ2.4に設定されたスイングアウトヘッドローター遠心分離機の2つの余分な遠心分離ステップ。(C)回転子の画像は、単核細胞調製管をスピンするアダプターを含む2つのバケットを含む。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 注: x g (RCF、相対遠心単位とも呼ばれます) と RPM (1 分あたりの回転数) は異なる単位です。 x g (RCF) の遠心分離機を設定してください。変換にはオンライン計算機 ( 材料表を参照) を使用します。固定角度ローターのみを使用できる場合は、1,500 ~ 1,800 x gで 10 分間このステップを実行します。 遠心分離後、バリアの下に暗い赤色の層(主に赤血球を含む)と、バリアの上に2層の存在を確認してください。最上層はプラズマ(わら色)で、下の白っぽい層はPBMCを含むバフィーコートです。これらのレイヤーは、暗い/黒の背景に対してチューブを表示するときに簡単に区別することができます。 図2:PBMCsを分離するチューブ。(A)遠心分離前の管の画像(ステップ2.4)、空(左)または血液(右)を含む。(B)遠心分離後のPBMC層の分離に成功した(ステップ2.5)。(C)遠心分離後のPBMC層の画像と、残されたプラズマのビットは、すべてのPBMCsが収集されることを確認する(ステップ2.7)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 注: これらのレイヤーが表示されない場合は、遠心単位の設定でエラーが発生している可能性があります。正しい遠心分離機アダプタが使用され、正しい”x g”が 設定されていることを確認します。ステップ 2.4 を繰り返します。 遠心分離の直後に、血清学的ピペットを使用して、PBMC層(約4〜5mL)を乱さないと注意しながら、プラズマの約半分をキャップ付きのラベル付き15 mLサイズの円錐遠心管に移します。このチューブを湿った氷の上にプラズマで一時的に保管し、ステップ4の後半で使用します。とりまいては脇に置いておきなさい。 細胞の層内にピペットを配置し、キャップ付きの異なる15 mLサイズの円錐形遠心分離管に移すことによって、パスツールピペットでPBMC層全体を収集します。必要に応じて、少量のプラズマを取って、すべてのPBMC層を完全に得ることもできます。容積は通常1-2 mLである。直ちに、以下の手順 3 に進みます。 3. PBMC洗浄工程 注:洗浄工程の目的は、PBMCペレットから残留血小板およびプラズマを希釈して除去することです。すべての遠心分離ステップは室温(18-25°C)で行われるべきです。 PBMCチューブに室温PBSを加えるため、体積を15mLにします。チューブをキャップします。管を5回そっと反転して細胞を混ぜます。 300 x gで 15 分間の遠心分離機これは、最初の遠心分離よりもはるかに穏やかな遠心分離であることに注意してください。 暗い/黒の背景に対してチューブを表示してペレットを視覚化します。真空吸引によって、またはピペットを使用して上清を取り除く(図3A)。白っぽい色のPBMCペレットの上に約500μLのボリュームを残して上清を捨てます。 図3:PBMCペレット。(A)第1の洗浄工程3.3で得られたペレット。(B)2回目の洗浄で単離されたペレット(ステップ3.7)。(C)2回目の洗浄で分離した血液の引き出しから4時間以降に処理された血液から得られる高レベルの血化を有するペレット(ステップ3.6)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 細胞ペレットを、残留上清で上下に軽くピペットして再懸濁します。 1x PBS を追加して、ボリュームを 10 mL にします。チューブをキャップします。管を5倍にそっと反転して細胞を混ぜます。分析プロトコルでセルカウントが必要な場合は、ステップ 3.5.1 に進み、必要でない場合はステップ 3.6 に直接移動します。 再懸濁細胞の40 μLアリコートを取り、40 μLのトリパンブルーと混合します。ヘモサイトメーターまたは自動セルカウンターを使用して生存細胞を数えます。 ステップ3.5から 300×gで10分間のサスペンションを遠心分離する。細胞ペレットを乱すことなく、合理的に可能な限り多くの上清を除去する。 慎重に除去し、細胞ペレットを乱すことなく、細かい先端パスツールピペットまたはマイクロピペットを使用してピペットを使用して、細胞ペレットの上に残りの上清を廃棄します。このステップを完了した後、ペレットの上にほとんど液体を残さない。このプロトコルのエンドポイントが PBMC ペレットの場合、ステップ 3.8 に移動します。エンドポイントが凍結保存された PBMCs である場合は、ステップ 3.10 に進みます。 50 μL の新しい PBS (またはエンドポイントに適用可能な場合はステップ 1.5 で調製した補充 PBS) をペレットに加え、マイクロピペットを使用してピペットを上下に加え、すべての細胞を均一に再懸濁させます。細胞懸濁液全体をラベル付きの1.5 mLのクライオビアルに移し、サンプルを凍結するまですぐに湿った氷の上に置きます。 ラベル付けされたサンプルを液体窒素に入れるか、または直接ドライアイスに入れて凍結します。細胞は、細胞凍結ボックスを使用して-80°Cの冷凍庫で凍結することもできる。この場合、セルチューブを加える前に、ボックスを-80°Cで完全にプレチルします。細胞ペレットが凍結された時間を記録します。細胞が凍結したら、-80°Cで保存し、ドライアイスで凍結した船。 必要に応じて、PBMCsを凍結混合物の1mLに再懸濁し、標識されたクライオビアルに移す。ステップ 3.9 で説明したように続けますが、この場合、セル凍結ボックスを使用してサンプルを凍結することしかできません。冷凍ボックスに入った後、最低24時間、出荷と保管のために液体窒素に移します。 4. プラズマ調製手順 (図 1A) PBMCペレットの-80°C貯蔵に続いて、ステップ2.6で一時的に湿った氷上に貯えられたプラズマアリコートを調製する。サンプルの目的がctDNA分析である場合は、次の遠心分離手順を実行して血漿を明らかにし、それ以外の場合はステップ4.2に直接移動します。 プラズマを固定角度ローター(またはスイングアウトローターで15分)で4〜8 °Cで1,600~2,000 x g で10分間遠心します。 慎重に任意のペレットを乱さないよう注意し、新しい15 mLチューブに転送し、プラズマ上清からピペット。ペレット化された材料を含むチューブを捨てます。 プラズマを固定角度ローター(またはスイングアウトローターで15分)で4〜8 °Cで1,600~2,000 x g で10分間遠心します。 プラズマ上清を新しい15 mLチューブに慎重に移し、ペレット化された材料を邪魔しないようにしてください。ペレット化された材料を含むチューブを捨てます。注:冷蔵遠心分離機が利用できない場合は、冷却室で各スピン、または遠心分離機のサンプルの間に5分間氷上の細胞を保持します。 1 mL アリコートのプラズマを 5 つの新鮮な 2 mL マイクロチューブに移します。5つのバイアルを1 mLアリコートで満たすのに十分なプラズマがなく、最後のバイアルが1mL未満のプラズマを含むことが予想される場合は、5バイアル未満を使用してください。5 mL以上のプラズマがある場合は、残りを捨てます。各チューブのプラズマの総量を記録します。 プラズマアリコートを直立に直ちに凍結し、−80°Cで保存します。 5. サンプル出荷 PBMCペレットとプラズマサンプルの両方をドライアイスに送ります。 出荷前および出荷中にサンプルが解凍されていないことを確認します。輸送中に発生する可能性のある遅延を考慮して、サンプルに十分なドライアイスを詰めて、出荷プロセス全体で凍結したままにします。 6. 全血照射とDDRバイオマーカーのウェスタンブロット分析 (図4A) 注:これは、クリニックのほとんどの場合に必要とされないex vivo治療ですが、これらの実験は、適切な臨床バイオマーカーを見つけるための貴重な探索的戦略です。最良の結果を得るためには、採取時にできるだけ早く血液サンプルを処理する必要があります。 X線キャビネットを温める。3つの15 mLチューブをそれぞれ0、0.2、7 Gyとラベル付けします。 単一の個体から採血したての血液を含む3つの単核細胞調製管を取り、管を8〜10回穏やかに反転した後、血液を3つの15 mLチューブに移す。 0.2 GyチューブをX線キャビネットに入れ、ドアを閉め、棚番号と線量を選択してチューブに0.2 Gy線量を塗布します。キャビネットで選択した線量を調整して7Gyチューブに7Gy放射線量を適用します。 37°Cで3本のチューブを1時間インキュベートします。 血液を単核細胞調製管に戻し、ステップ2.4からステップ3.8までの臨床設定に関してPBMC調製プロトコルを実施する。 各細胞ペレットに、細胞ペレットの体積(この場合は70 μLのRIPAバッファー)に等しいプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を添加したリシスバッファーの体積を加え、ピペットを上下に加え、氷上で10分間インキュベートします。超音波処理器が利用可能な場合(3サイクル、30 s ON / 30 s OFF、4°C)、代わりにサンプルの粘度を排除するために核酸を壊すためにサンプルを注射する場合は、サンプルを超音波処理します。 サンプルを10分間、≥15,000 x g、4°Cで遠心分離します。 各上清を新しい1.5mLチューブに移し、その濃度を定性的に評価し(目視検査)し、好ましい方法でタンパク質濃度を測定します。 SDSおよびサンプル還元剤を含むサンプルローディングバッファーと全リセートの40 μgを混合します。ヒートブロックでサンプルを5分間沸騰させます。 4-12%ビストリスタンパク質ゲルに各レーン当たりのサンプル20 μgを重複してロードし、SDS-PAGEを実行します。 分離後、市販のシステム(20V、10分)を用いてニトロセルロース膜にタンパク質を移し、TBSTで5%乳をブロックします。 関連する分子サイズで膜を切断し、一次抗体を一晩4°Cでインキュベートします(抗体および希釈剤 の材料表 を参照)。 一次抗体を取り除き、膜を室温で5分間TBSTで3回洗浄します。HRP結合二次抗体を室温で45分間インキュベートします。 TBSTで3回5分間洗います。 ECL試薬を適用し、HRP信号に対して得られた画像を分析します。

Representative Results

臨床試験におけるPBMC製剤の品質を向上させるために、私たちは、分子生物学の背景と実験室のスキルとは無関係に、病院の研究室の専門家が続くことができる簡潔で明確なステップを備えたプロトコルを生成しました。当社は、さまざまな多施設臨床試験に関与する臨床現場から実行問題が特定または報告されたステップに変更を組み込んだメーカーのプロトコルを適応させました。ただし、臨床現場の時間の制約やダウンストリーム分析の種類など、特定の要件を満たすようにプロトコルをさらに最適化できます ( 補足ファイルを参照)。放射線によるDNA損傷時の特異的バイオマーカーを見ることで、DDRをPBMCで解析できることを実証した。 臨床現場から受け取った最も一般的な問い合わせは、PBMCsを正常に分離し、最終的なPBMCペレットを得ることができるという遠心分離ステップに関連しています。適切なタイプのスイングアウトヘッドローター遠心分離機(図1B,C)を使用することが、プロトコルの成功の鍵となります。しかし、臨床現場で固定角度ローター遠心分離機のみが利用可能な場合は、スイングアウトヘッドローターと同じRCFの固定角度ローターでステップ2.4を10分間だけ実行することをお勧めします。これにより、PBMC層がプラズマから分離されることが保証されます(図2B,Cを参照)。密度勾配分離媒体に血液を重ね合うにはブレーキオフ遠心分離が必要であるが、単核細胞調製管内の血液は、より高密度の血液成分27,28から分離されたPBMC層の保存を確実にするチューブ内のゲルバリアの存在により、ブレーキで遠心することができる。 少なくとも4 mLの高品質の非希釈血漿は、8 mLチューブ形式の血液の遠心分離から得られ、ctDNAシーケンシングまたはメタボロミクス研究29,30(オプションステップ4.1-4.1.4)などの特殊な分析での使用のためにさらに明確化することができた。単離されたPBMCの量、ペレットおよび血中炎または赤血球汚染のサイズは、臨床現場およびサンプルの分析経験から来る他の懸念であった。8mLの血液から得られた細胞の数は、患者や疾患の設定によって可変であったが、一般的に得られるペレットはサイズが小さく、透明/白色化した(図3A、B)。これらの特性のために、洗浄ステップ(2.5および3.3)の間に偶然の吸引を避けるために、暗い背景に対してペレットを視覚化することが重要です。時々ペレットは赤血球汚染(図3C)のために赤い着色を有することができ、これは準備の質に悪影響を及ぼす。図3に示すような小さなペレットを失わないように、PBMCペレットをクライボビアルに移す作業は、ステップ3.7により容易に行われ、そこでPBMCペレットはPBSの50μLで再懸濁されます。 健康な個体からのこれらの管および血液を使用する場合の典型的な収量は、8 mLの7〜21 x106細胞の範囲であり、我々の経験と同様に70〜80%の間の細胞回復と、以前に示されたとおり27,28である。これは、個々の細胞数とオペレータの両方に依存し、密度勾配(分離バリアを有する管を利用するシステムを含む)を用いた他の方法で得られる細胞数および細胞回収値に匹敵する15、27、28である。疾患の設定に応じてこの方法で単離されたPBMCsの数の変動の例示例は、慢性リンパ性白血病(CLL)患者におけるPBMCマーカーの分析である。このプロトコルを適用する際に8 mL単核細胞調製管から回収された細胞の数は、研究NCT03328273 31の7人の患者から得られた45サンプル中の1.62 x104から1.99 x109に変化した(表1)。関連するパラメータは、この方法で得られるPBMCライセートのタンパク質濃度であり、これは、単離された細胞の数およびタンパク質抽出の効率に依存する。セクション6でlysedされた細胞ペレットを、RIPA緩衝液および超音波処理で生成した(ステップ6.6)。同じ量のリセシスバッファー内の細胞ペレットの再懸濁は、通常、3〜10 mg/mLの濃度の範囲をもたらし、この特定の例では、リセート濃度はそれぞれ0、0.2および7 Gyの6.8、8.3および8.6mg/mLであった。しかし、これは、最適に調製されていない臨床現場からサンプルを受けるとき、患者の病気、および赤血球汚染からのヘモグロビンの存在を受けるとき、高いばらつきを受ける。例えば、非常に小さなペレットは、タンパク質濃度の測定と下流のバイオマーカー分析の両方を可能にするために、細胞ペレット容量よりも大きいリシスバッファーの体積に再懸濁する必要があり、結果としてより希釈されたサンプルが得られます。このような場合、サンプル濃度が1mg/mL未満の場合、この高希釈因子によるウェスタンブロットのようなアッセイを行う上で難しい場合があります。これに対し、前述したCLLサンプルでは、細胞ペレットを再懸濁するために添加したリシスバッファーの体積は50~500μL、タンパク質濃度は1.62~19.77mg/mLに及んだ(表1)。 サンプルが赤血球の汚染または血糖化(図3C)を提示すると、赤血球由来のヘモグロビンが含まれているためPBMCリセートのタンパク質濃度が過大評価されます。プロトコルのステップ 6.7 で説明されているように、このようなサンプルの目視検査と注釈を行う必要があるのは、このためです。過剰に負荷試料は、ローディング制御がアッセイに含まれる限りバイオマーカー分析を行う際にヘモグロビンの存在を補償することができる。414 nm32での吸光度測定など、他のより定量的な方法で、その他の法を測定する方法を実施することができる。 DDRをこの臨床プロトコルに従って得られたPBMCで分析した。放射線療法や化学療法などの臨床治療にダメージを与えるDNAを模倣した状況を例示するために、健康なボランティアからの全血は、X線放射を受けたex vivoを行った(図4A)。X線などの電離放射線(IR)は、DNA二重鎖切断(DSB)を含むさまざまな種類のDNA損傷を引き起こす。これらの病変のDNA損傷センシングは、変性血管拡張症(ATM)、ATMおよびRad3関連(ATR)およびDNA依存性タンパク質キナーゼ(DNA-PK)などのPIKを活性化し、相同組換え(HR)または非相同末端結合(NHEJ)のようなDNA修復メカニズムに従事する。DSBの存在によるATMの活性化は、MRN(MRE11-RAD50-NBS1)複合体による損傷部位へのリクルートによって起こり、Ser1981を含むいくつかの残基でATM自己リン酸化を引き起こす。さらに、活性化されたATMは、MrN複合体およびヒストン変異体H2AXなどの他のタンパク質の成分をSer139(pSer139-H2AXはγH2AXとも呼ばれる)にリン酸化して、DSBから及ぶクロマチンの構造変化を促進し、他のDDR因子33の採用を促進する。PBMCは低い拡散速度にもかかわらず電離放射線に応答し、質量分析法はATMによってRAD50上のリン酸化Ser635のアップレギュレーションの定量化を可能にした。このリン酸化は、ATM阻害剤およびRAD50 pS635の存在下で減少し、免疫組織化学8による腫瘍における臨床的なATM阻害剤治療のための薬物力学的バイオマーカーとしてさらに検証されている。PBMCの放射線への応答を評価するために、健常志からの血液を異なるIR線量に供し、37°Cで1時間培養した後にサンプルを採取した(図4A)。この目的のために、血液をプラスチックチューブに移し、高温によるPBMC分離の収率を低下させないようにした(ステップ6.2)。我々は、以前に報告されたRAD50 pS635だけでなく、ATM pS1981およびγH2AXを見てATMがどのように活性化されたかを分析した。これら翻訳後修飾の増加を調べた3例では、より高いIR用量で観察された(図4B)。興味深いことに、ATMとRAD50のリン酸化は0.2 Gyの低用量で実質的であったため、これらの翻訳後修飾は、腫瘍サンプルだけでなく末梢血において、良好なダイナミックレンジを有するDNA DSBの生成を伴う治療のためのPDバイオマーカーとして現実的に尋問される可能性があることを示唆している。これにより、治療の過程を経て縦方向サンプルを取得することにより、治療に対するPD応答のモニタリングが可能となる。血液の引き出しからサンプルの処理までのタイミングは、処理の遅れがこのようなカスケードの動態に影響を与え、ホスホマーカーとして使用されるリン酸化イベントを見逃す可能性があるため、これらのシグナル伝達カスケードがまだアクティブであることを保証するために重要です。 図4:本臨床プロトコル表示バイオマーカーに続くex vivo照射血液から分離されたPBMCsは、治療によって引き起こされるDNA損傷の程度を知らせる。(A) 全血照射時のPBMCの調製およびDDRの分析のためのプロトコルの概略図。*2 ctDNA分析/メタボロミクスに必要な余分な遠心分離ステップ。(B) PbMCにおけるDDRホスホバイオマーカーの用量依存性のアップレギュレーションを示すウェスタンブ ロット。 見本 PBMCs/8 mL血液の数 補足された RIPA バッファボリューム (μL) 最終濃度 (mg/mL) A.1 39100000 70 12.16 A.2 97400000 100 4.54 A.3 233000000 150 7.63 A.4 316000000 150 16.87 A.5 387000000 150 12.60 A.6 459000000 150 12.71 A.7 414000000 200 15.67 A.8 253000000 150 14.56 A.9 509000000 300 10.67 B.1 15200000 70 2.96 B.2 10500000 50 4.59 B.3 13200000 50 3.99 B.4 34800000 100 10.41 B.5 1620000 70 7.11 B.6 70200000 100 9.26 B.7 65400000 100 12.10 B.8 91100000 150 11.82 C.1 6330000 70 4.04 C.2 4400000 150 19.77 C.3 68000000 100 8.96 C.4 35100000 50 9.30 C.5 35400000 70 10.55 C.6 99200000 100 16.19 D.1 402000000 70 7.23 D.2 826000000 300 16.95 D.3 1990000000 300 14.87 D.4 1000000000 300 18.34 D.5 1160000000 400 16.13 D.6 806000000 400 19.40 E.1 302000000 300 13.86 E.2 990000000 500 19.04 E.3 1200000000 400 17.13 F.1 4010000 50 1.62 F.2 5170000 50 2.84 F.3 2810000 50 3.69 F.4 3700000 75 3.62 F.5 3460000 70 4.03 F.6 7060000 50 3.32 G.1 60700000 70 6.57 G.2 82100000 150 7.78 G.3 30500000 70 8.28 G.4 134000000 100 15.14 G.5 91900000 100 8.61 G.6 372000000 150 15.88 G.7 574000000 200 15.01 7人の患者に対応する縦方向PBMCサンプル 表1:慢性リンパ球性白血病患者からのPBMCペレットの細胞数およびタンパク質濃度(CLL)。 この表に示すデータは、単核細胞調製管で収集された研究NCT03328273に参加した7人のCLL患者からの45 PBMCサンプルに対応する。これらは、引用された研究31のサンプルを用いて生成されたオリジナルデータである。 補助ファイル: 代替プロトコル オプション。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

臨床試験現場で堅牢かつ再現的に調製できるPBMCおよび血漿の高品質な調製は、臨床試験の周辺予測および薬力学トランスレーショナルバイオマーカーエンドポイントを知らせるのに非常に貴重です。ここでは、これまで臨床試験の設定で実行エラーに対して脆弱であった典型的な問題のあるステップに対処する短く明確なプロトコルを提供しました。ただし、臨床現場での時間の制約やダウンストリーム分析の種類など、特定の要件を満たすようにプロトコルをさらに最適化できます ( 補足ファイルを参照)。

この目的のために、我々は、単核細胞調製管を用いてPBMCと血漿の両方を全血から分離し、様々な下流分析に適した凍結PBMCペレットおよび凍結プラズマを生成する方法を示した。我々は、ステップ2.5でPBMC層の遠心分離および同定を伴う特に重要なプロトコルステップ、およびステップ3.3および3.6のPBMCペレットに注意を喚起した。歴史的に、臨床現場がしばしば間違っているのは、遠心分離機を正しい単位に設定すること(RCFまたはxg値をRPM値と混同する)、血液サンプルの処理、温度、および凍結細胞ペレットの上に大量のPBSの存在を遅らせることである。ほとんどの遠心回転子で誤ってrpm設定としてxg値を入力すると、PBMC層の定義が不十分または存在しない結果、PBMCの不効率な細胞ペレットによる洗浄工程中に廃棄される可能性のある、重要な心心下の遠心が生じます。しかし、患者が白血病を発症した場合、正しい遠心分離設定とローターアダプターを使用しているにもかかわらず、PBMC層が見えない可能性があります。この状態は、化学療法や放射線療法のために腫瘍学試験に登録された患者に影響を与える可能性があり、考慮する必要があります。プロトコルで明らかにされているもう一つの重要なポイントは、血化がプロトコルに悪影響を及ぼす可能性を減らすには、血液採取から1〜2時間以内にサンプルを処理しなければならないということです。さらに、血液採取の最初の1時間の間にサンプルを処理することを目指しては、ex vivo変動を減少させ、これは、図4に示す例のような血液保存または活性シグナル伝達経路によって影響を受ける薬物動態の読み出しおよびバイオマーカーに大きな影響を与える可能性がある。サンプル処理の遅延は、細胞が凍結保存される場合、細胞生存率に有害な影響を及ぼす可能性もあります34.収量と赤血球汚染の両方に影響を与えることができるもう一つの要因は、貯蔵および遠心温度であり、これは室温(18〜25°C)に保たれるべきである。温度が低いと密度勾配媒体の密度が高くなり、これらの細胞も凝集しなくなるため、赤血球の濃度が高くなり、顆粒球汚染が高くなります。一方、より高い温度は凝集赤血球の間に捕らえPBMCsを導き、従って調製物15、27、28の収率を低下させる。そして最後に、これらのPBMC製剤の下流処理で得られたタンパク質ライセートの濃度に悪影響を及ぼすため、50〜100μL以下の液体が極低温中の細胞ペレットに存在することが重要です。過剰な液体はサンプルを過剰に希釈し、バイオマーカー分析には適さない非常に低いタンパク質濃度のライゼートにつながります。また、翻訳後の改変の保存が損なわれ、ライシスの効率も大幅に低下します。

単核細胞製剤チューブは、臨床試験のための単一の血液ドローでPBMCと血漿の両方を分離する最も簡単な方法を提供し、我々の経験では、優れた再現性を備えたものとして選ばれました。血液処理は高度な訓練を受けたオペレータを必要とせず、単一のチューブを使用すると血液を希釈する必要性と別のチューブへの移動が不要になり、危険リスクが低下します。ブレーキをオンにして遠心分離ステップを実行するため、プロトコルを短縮します。そしてすべての試薬は、可変性を低減するチューブ内にあります。我々の経験では、これらの利点は、密度勾配分離媒体27、28(60単位あたり£410、66 50-mL製剤のためのリンパ調製培地は£215である)のみを含む他の古典的な方法と比較して、これらのチューブの高コストを上回る。これらは、分離されたPBMCs35の機能性を維持するのに匹敵するヘパリンとクエン酸の2種類の抗凝固剤で利用可能であり、したがって、他方に対する1つの抗凝固剤の選択は、下流のバイオマーカー研究におけるヘパリンまたはクエン酸の影響に基づく。EDTAチューブは、ヘパリンまたはクエン酸13と比較して最高PBMC分離収率を提供することが示されているが、1管のみの操作の使いやすさの利点は、この考慮事項を相殺する。サイトカインが分析される場合は、抗凝固剤が血漿中で検出されたレベルの効果を有することができるので、臨床試験36のために1つを選択する前に両方の抗凝固剤を試験する必要があります。血漿がメタボロミクス研究に使用される場合、ヘパリンを抗凝固剤として使用することが好ましい37.したがって、エンドユーザーまたは臨床試験の翻訳科学者に残された唯一のポイントは、コストが評価された後、クエン酸またはヘパリンが目的に適しているかどうかです。

細胞製剤チューブを使用することの利点は、それらがもたらされる制限(抗凝固剤の制限範囲のより高いコストと可用性)と比較して数多くありますが、臨床試験、特に腫瘍学において、PBMCsまたは血漿を使用してPDバイオマーカーを得るという主な制限は、分離方法とは無関係であり得る。腫瘍が末梢血から直接サンプリングされる血液学的癌を除いて、他の癌適応症の血漿およびPBMCは、必ずしも原発性腫瘍を模倣しない代理組織である。末梢組織は、ゲノムおよびエピゲノムを原発腫瘍と共有しない場合があり、したがって、特定の腫瘍突然変異に依存するバイオマーカーの末梢解析は、主にctDNA(血漿由来)またはCTC(PBMC層のその後の分類による)に限定される。また、シグナルカスケードが腫瘍増殖に寄与する、あるいは腫瘍増殖に寄与するシグナル伝達は、末梢血において活性でない可能性がある。この課題は、血液8 を標的とするバイオマーカー発見アプローチを適用して、代替バイオマーカーを同定するか、または血漿38 およびPBMC製剤26の単離に対するエクスビボ治療を結合させることによって克服することができる。

現在のプロトコルでは、凍結されたPBMCペレットは、ウェスタンブロッティングまたはELISA技術によって評価することができるタンパク質ライセートを与えるために臨床部位から容易に処理することができる。IHC メソッドを有効にする PBMC を使用する別の方法も提示されています (補足ファイル)。さらに、腫瘍学に関連する応用である免疫細胞モニタリングに対してPBMC(補足ファイルを参照)を凍結保存する可能性についても詳しく説明し、免疫チェックポイント阻害剤およびADCが臨床試験でますます試験されています。ADCC16や免疫フェノタイピングなどの免疫機能の評価は、単核細胞調製管15から分離された凍結保存されたPBMCと互換性のあるアプリケーションである。凍結保存には、特定の表面および内部マーカーのダウンレギュレーションを促進し、特定の細胞機能を損なう可能性があるため、凍結保存は、複数の臨床現場から外部ラボ14、15の処理までのサンプルを処理する際に時間的制約のためにこれらのアッセイを行う唯一の実行可能な方法であり、これらの有害な影響は良好な解凍方法と休止期間390によって大きく克服することができる。

結論として、ここで提供されるプロトコルは、世界的な臨床試験で末梢血からの翻訳エンドポイントを堅牢に可能にできるように、共通の機器や材料を備えたあらゆる臨床機関でPBMCと血漿サンプルの信頼性の高い調製を可能にする。

最後に、PBMCライセートの分析が、臨床開発の形成に役立つ主要なDDR因子の用量依存的な翻訳後修飾を示すことによって、DNA損傷剤に対する応答を機械的に知らせることができる方法を示す。前向きには、ウェスタンブロッティング(例えば、質量分析40)よりも定量的で、より少ない投入材料(毛細管ウェスタンブロッティングおよびELISAなど)を必要とする方法の実施は、PBMC患者サンプルのより堅牢で体系的な評価に向けてこれらの前臨床結果を移動するのに役立ちます。

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

アストラゼネカ腫瘍学研究開発および早期開発のトランスレーショナルメディシンのすべてのメンバーに、プロトコルに関するフィードバック、特にヘドリー・カー、タミー・イェー、ネイサン・スタンディファーに対するctDNA分析のための血漿製剤、PBMC分離、PBMC凍結保存および免疫フェノタイピングに関するアドバイスに感謝します。

Materials

1.5 mL cryovial Nalgene, ThermoFisher 5000-1020 To store PBMC pellets and re-suspended PBMCs
1.5 mL microcentrifuge tubes VWR 525-0990 This is an example, use your preferred provider
15 mL conical sterile propylene centrifuge tube Nunc, ThermoFisher 339651 Other brands can be used
2 mL screw cap tube sterile, with attached cap ThermoFisher 3463 For plasma aliquoting
20X TBS Buffer ThermoFisher Scientific 28358 Final is 25 mM Tris, 0,15 M NaCl; pH 7,5. This is an example, you can prepare your own stock or use a different provider
20X TBS Tween 20 Buffer ThermoFisher Scientific 28360 Or supplement TBS with 0.05% to prepare TBST buffer
Automated cell counter or haemocytometer ThermoScientific AMQAX1000 We use Countess device and slides but could be other methods.
Adjustable micropipette allowing 50 µL measurements To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes)
BD Vacutainer CPT mononuclear cell preparation tube (Na-citrate or Na-heparin) 8 mL BD 362761, 362753 There are 4 mL tubes but if possible 8 mL tubes are recommended to obtain more PBMCs from a single blood draw
Cell-freezing box ThermoFisher Scientific 5100-0001 This is an example, use your preferred provider.
Centrifugation unit converter LabTools http://www.labtools.us/centrifugation-speed-rpm-to-g-conversion/
DMSO Sigma-Aldrich, MERK D2438 Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation
ECL horseradish peroxidase substrate ThermoFisher 34075 Use your preferred reagent according to the sensitivity required to detect your biomarker by western blot. Other systems can be used such as IRDye secondary antibodies with imaging systems.
Faxitron MultiFocus X-ray cabinet Faxitron Bioptics To irradiate blood. Other models/makers are available
Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated ThermoScientific 102706 Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation
Fine tip, sterile 1.5 mL Pasteur pipettes VWR 414004-018 Optional
Fixed-angle rotor centrifuge Optional for preparation of plasma for ctDNA/metabolomics
Gel doc imaging system SYNGENE For imaging HRP developed membranes
Heat block To denature lysates prior to run them in western blot, any maker equipped with suitable tube adaptors
Horizontal rotor (swing-out head) centrifuge Thermoscientific Heraeus Megafuge 40R This is an example
Liquid nitrogen/dry ice To flash-freeze samples
Marvel dried skimmed milk Premier Foods This is an example, use your preferred provider
Micropipette tips for range 1-200 µL To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes)
NuPAGE 4-12% Bis-Tris protein gel, 1 mm, 10 wells ThermoFisher Scientific NP0321BOX This is an example, cast your own or use your preferred provider
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) ThermoFisher Scientific NP0007 For imaging HRP developed membranes
NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) ThermoFisher Scientific NP0009 This is an example.
PBS, no calcium, no magnesium Gibco, ThermoFisher 14190-144 This is usually provided in the clinical kit.
Phosphatase inhibitor cocktail 2 Sigma-Aldrich, MERK P5726-1ML Optional for step 3.7
Phosphatase inhibitor cocktail 3 Sigma-Aldrich, MERK P0044-1ML Optional for step 3.7
Rabbit anti GAPDH Cell Signaling Technology CST 2128 1:1000 dilution in 5% milk TBST
Rabbit anti γH2AX Cell Signaling Technology CST 2577, lot 11 1:2000 dilution in 5 % milk TBST
Rabbit anti pS1981 ATM Abcam ab81292 1:2000 dilution in 5 % milk TBST
Rabbit anti pS635 RAD50 Cell Signaling Technology CST 14223 1:1000 dilution in 5 % milk TBST
Rabbit anti total ATM Abcam ab32420 1:1000 dilution in 5 % milk TBST
Rabbit anti total RAD50 Cell Signaling Technology CST 3427, lot 2 1:1000 dilution in 5 % milk TBST
RIPA buffer Sigma-Aldrich, MERK R0278-50ML For cell lysis. This is an example, use your preferred provider
Sonicator Diagenode B01060010 Used for 3 cycles at 30 s on/ 30 s off, 4 oC. If using a different instrument, adjust number of cycles and intensity according to your sonicator.
Sterile 1.7 mL Pasteur pipettes VWR 414004-030 This is an example, use your preferred provider
Sterile serological pipettes (5 and 10 mL volume) Costar 4101, 4051 This is an example, use your preferred provider
Trypan blue ThermoScientific T10282 This is for the automated cell counter listed above.
Wet ice To keep plasma samples and lysates cold
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Marco-Casanova, P., Lukashchuk, N., Lombardi, B., Munugalavadla, V., Frigault, M. M., Harrington, E. A., Barrett, J. C., Pierce, A. J. Preparation of Peripheral Blood Mononuclear Cell Pellets and Plasma from a Single Blood Draw at Clinical Trial Sites for Biomarker Analysis. J. Vis. Exp. (169), e60776, doi:10.3791/60776 (2021).
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