Herstellung von peripheren mononukleären Blutzellpellets und Plasma aus einer einzigen Blutentnahme an klinischen Studienstellen für die Biomarkeranalyse
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die klinisch implementierbare Vorbereitung von hochwertigen PBMC- und Plasma-Bioproben am klinischen Studienort, die für die translationale Biomarkeranalyse verwendet werden können.
Abstract
Die Analyse von Biomarkern im peripheren Blut wird in klinischen Studien immer wichtiger, um den Nachweis eines Mechanismus zur Bewertung der Wirkungen der Behandlung zu erbringen und die Dosis- und Zeitplaneinstellung von Therapeutika zu steuern. Aus einer einzigen Blutentnahme können periphere mononukleäre Blutzellen isoliert und verarbeitet werden, um Proteinmarker zu analysieren und zu quantifizieren, und Plasmaproben können für die Analyse von zirkulierender Tumor-DNA, Zytokinen und Plasmametabolomik verwendet werden. Längsschnittproben aus einer Behandlung geben Aufschluss über die Evolution eines gegebenen Proteinmarkers, den Mutationsstatus und die immunologische Landschaft des Patienten. Dies kann nur erreicht werden, wenn die Verarbeitung des peripheren Blutes effektiv an klinischen Stellen durchgeführt wird und die Proben vom Krankenbett bis zur Bank ordnungsgemäß konserviert werden. Hier stellen wir ein optimiertes Allzweckprotokoll vor, das an klinischen Standorten zur Gewinnung von PBMC-Pellets und Plasmaproben in multizentrischen klinischen Studien implementiert werden kann und es klinischen Fachkräften in Krankenhauslabors ermöglicht, unabhängig von ihrem technischen Fachwissen erfolgreich qualitativ hochwertige Proben bereitzustellen. Es werden auch alternative Protokollvariationen vorgestellt, die für spezifischere nachgelagerte Analysemethoden optimiert sind. Wir wenden dieses Protokoll an, um Protein-Biomarker gegen DNA-Schadensreaktion (DDR) auf röntgenbestrahltem Blut zu untersuchen, um die Eignung des Ansatzes in onkologischen Umgebungen zu demonstrieren, in denen DDR-Medikamente und / oder Strahlentherapie praktiziert wurden, sowie in präklinischen Stadien, in denen mechanistische Hypothesentests erforderlich sind.
Introduction
Die Arzneimittelentwicklung zielt darauf ab, neue Therapeutika für unerfüllte medizinische Bedürfnisse und gezieltere, personalisierte Medizin bereitzustellen. Mehrere Arzneimittelmechanismen werden aktiv untersucht, einschließlich enzymatischer Hemmung wie Kinase1, Protease2oder Poly (ADP-Ribose) Polymerase (PARP) Inhibitoren3, Proteindegrader4, therapeutische Antikörper5und Antikörper-konjugierte Medikamente (ADCs)6, unter vielen anderen. Ein Beispiel für die Bemühungen, bessere Behandlungen in der Onkologie zu erhalten, ist die Verwendung von Kinasehemmern mit dem Ziel, die Signalkaskaden zu stoppen, die Krebszellen vermehren1,7. Die Messung der für diese Kinasen spezifischen Substratephosphorylierung ist der beste pharmakodynamische Biomarker, um den Wirkungsmechanismus dieser Inhibitoren zu quantifizieren8. Andere Medikamente können die Expression eines bestimmten Proteins modulieren, und in diesem Fall ist es von größter Bedeutung, die Konzentrationsänderungen ihres Zielproteins während des gesamten Behandlungsverlaufs longitudinal quantifizieren zu können. Daher ist unabhängig von den Eigenschaften eines Arzneimittels oder einer Pathologie die Bewertung von Biomarkern zur Feststellung der pharmakokinetischen (PK) / pharmakodynamischen (PD) Beziehung zwischen Arzneimittelexposition und Zielmodulation die beste Praxis in der frühen klinischen Entwicklung und ermöglicht die Bestimmung einer sicheren und tolerierten pharmakologisch aktiven Dosis / Liste9.
Während in der onkologischen klinischen Entwicklung die Biomarkeranalyse in Biopsien der beste Rahmen sein könnte, um den Nachweis des Mechanismus eines Arzneimittels zu erbringen, ist die Anzahl der verfügbaren Biopsien in einer Studie in der Regel ziemlich begrenzt10,11. Alternativ sind periphere Blutproben für klinische Studien sehr wertvoll, da sie ein minimalinvasives Verfahren beinhalten, schnell und einfach zu erhalten sind, um die Längsschnittanalyse zu erleichtern, kostengünstiger sind als Biopsien und umfangreiche Informationen für die Echtzeitüberwachung des Ergebnisses einer Behandlung liefern. Ein zusätzlicher Vorteil bei der Bewertung von PD-Biomarkern im peripheren Blut ist die Fähigkeit, das Biosample zu verwenden, um PK auch zu quantifizieren, was die Genauigkeit bei der Bestimmung der quantitativen PK/PD-Beziehungen und der anschließenden PK/PD-Modellierung ermöglicht12,13. Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) aus Vollblut können isoliert werden, um Proteinmarker zu untersuchen, die entweder Veränderungen in ihrem Expressionsniveau oder in ihren post-translationalen Modifikationen erfahren. Darüber hinaus können PBMCs für Immunphänotypisierungszwecke14,15, Immunfunktionalitätsassays wie die Beurteilung der Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizität (ADCC)16 und die epigenetische Analyse durch RNA-Isolierung verwendet werden. Ebenso kann Plasma aus Vollblut verwendet werden, um Zytokine zu quantifizieren, um die immunologische Reaktion eines Patienten zu charakterisieren, metabolische Studien durchzuführen und auch zirkulierende Tumor-DNA (ctDNA) zu isolieren und zu sequenzieren, um die klonale Entwicklung der Krankheit unter Selektion aus dem therapeutischen Wirkstoff zu überwachen, was häufig eine mechanistische Grundlage für die Behandlungsresistenzbietet 17,18,19, die die Entwicklung nachfolgender Generationen von Therapeutika ermöglicht20. Schließlich ermöglicht die Isolierung zirkulierender Tumorzellen (CTCs) aus peripherem Blut die Beurteilung des Krankheitsverlaufs durch longitudinale Enumeration, DNA/RNA-Sequenzierung und Protein-Biomarker-Analyse21. Obwohl diese Isolierung mit dem hier beschriebenen Protokoll22kompatibel ist, macht die geringe Häufigkeit von CTCs in vielen Krebsarten und frühen Stadien der Krankheit die Verwendung von spezialisierten Röhrchen besser geeignet, um den CTC-Abbau zu minimieren23.
In den letzten Jahren hat die Verwendung von Flüssigbiopsien die in klinischen Studien erhaltenen Informationen verbessert, und PBMC-Sammlungen wurden in viele Studien aufgenommen, um die Zielbindung und den Nachweis des Mechanismus entweder direkt in Tumorzellen für einige Arten von hämatologischen Malignomen oder auf den PBMCs selbst als PD-Surrogate von Tumorzellen zu überwachen24,25,26. Die Vorbereitung hochwertiger Proben wirkt sich positiv auf die Bestimmung der sichersten und wirksamsten Behandlung für eine bestimmte Pathologie aus, aber nach unserer Erfahrung wurde die Qualität von PBMC-Präparaten, die von verschiedenen klinischen Standorten erhalten wurden, einer großen Qualitätsvariabilität ausgesetzt, was zu Proben führte, die für den Zweck der nachgelagerten Analyse nicht geeignet sind. Dies hat sich auf die Menge der PD-Daten ausgewirkt, die aus diesen Studien gesammelt werden konnten.
Hier beschreiben wir detailliert ein einfach zu befolgendes Protokoll, das zeigt, wie sowohl PBMCs als auch Plasmaproben aus einer einzigen Blutentnahme in einer klinischen Umgebung effizient isoliert werden können. Das Protokoll basiert auf den Anweisungen des Herstellers der mononukleären Zellvorbereitungsröhrchen, die Modifikationen enthalten, bei denen reale Erfahrungen Schwierigkeiten bei der Protokollausführung aufgezeigt haben, wie sie von klinischen Standorten gemeldet wurden, wie z. B. Zentrifugationsprobleme, Verarbeitungsverzögerungen und Probentransfer zu Kryovialen. Es gibt alternative kommerziell verfügbare Methoden zur Verwendung von mononukleären Zellpräparationsröhrchen auf der Grundlage der Dichtegradiententrennung unter Verwendung von Polysaccharidlösungen mit oder ohne Barriere, die die Lösung vom Blut trennt27. Wenn die betreffende klinische Stelle bereits über gute Erfahrung mit diesen alternativen Methoden verfügt, kann dieses Protokoll akzeptabel durch diese ersetzt werden. In solchen Fällen können zwei Faktoren berücksichtigt werden: Einige alternative Methoden erfordern einen Transfer von Vollblut aus einem Entnahmeröhrchen in ein separates Präparationsröhrchen, wobei ein zusätzlicher Transfer von humanem primärem biologischem Material ein leicht erhöhtes Sicherheitsrisiko darstellen kann, und der Erfolg von Methoden ohne Barrieren, die das Blut von der Polysaccharidlösung trennen, hängt von kritischen Schritten ab, wie z. B. der Schichtung der Blutprobe auf dem Dichtegradientenmedium, das die Entwicklung eines verfeinerten technischen Fachwissens erfordert, das in einem Krankenhauslabor nicht immer zu finden ist. Ungeachtet der vorstehenden Punkte sind die Gesamtlebensfähigkeit und zellerholung zwischen diesen Techniken vergleichbar15,28. Die Wahl der Methodik hängt daher etwas von früheren technischen Erfahrungen ab, aber in unseren Händen können mononukleäre Zellpräparationsröhrchen erfolgreich in einem breiten klinischen Kontext eingesetzt werden und sind ansonsten unsere Empfehlung.
Während ein Endpunkt dieses Protokolls die Herstellung von PBMC-Pellets für die Weiterverarbeitung zu Lysaten ist, könnten andere endgültige Anwendungen der PBMC-Sammlung implementiert werden, wie die Isolierung von Nukleinsäuren oder die Herstellung von PBMC-Abstrichen oder PBMC-Blöcken, die für immunhistochemische (IHC) Methoden geeignet sind. Da jedes Biosample von Patienten zumindest auf einer gewissen Ebene ein invasives Verfahren darstellt, maximiert dieses Protokoll das nützliche Material aus jeder Probe, indem es auch Plasma isoliert, das für Zytokinanalysen, metabolomische Studien oder ctDNA-Sequenzierung verwendet werden kann.
Die Analyse peripherer Biomarker in onkologischen Studien ist eine der vielen Anwendungen von PBMC-Lysaten. Ein Beispiel ist die Bewertung der DNA-Schadensreaktion (DDR) bei Behandlungen wie Chemotherapie, Strahlentherapie oder der Verwendung von Inhibitoren von Enzymen, die an der DDR beteiligt sind, wie die Phosphatidylinositol-3-Kinase-verwandten Kinasen (PIKKs)7 und PARPs3,13. Ziel dieser Behandlungen ist es, DNA-Schäden in proliferierenden Zellen zu erhöhen, was eine hohe Toxizität in Zellen mit beeinträchtigten DDR-Mechanismen und Zellzyklus-Checkpoints wie Krebszellen erzeugt. Hier präsentieren wir ein Beispiel mit einer Studie von DDR-Biomarkern in peripherem Blut, das Röntgenstrahlen ausgesetzt ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hochwertige Präparate aus PBMCs und Plasma, die robust und reproduzierbar an klinischen Studienstellen hergestellt werden können, sind von unschätzbarem Wert, um periphere prädiktive und pharmakodynamische translationale Biomarkerendpunkte für klinische Studien zu informieren. Hier haben wir ein kurzes, klares Protokoll bereitgestellt, das die typischerweise problematischen Schritte behandelt, die bisher anfällig für Ausführungsfehler in einer klinischen Studie waren. Das Protokoll kann jedoch weiter optimiert werden, um spezifische Anforderungen zu erfüllen, wie z.B. Zeitbeschränkungen am klinischen Standort oder Art der nachgelagerten Analysen (siehe Ergänzungsdatei).
Zu diesem Zweck haben wir gezeigt, wie sowohl PBMCs als auch Plasma aus Vollblut mit mononukleären Zellpräparationsröhrchen isoliert werden können, um gefrorene PBMC-Pellets und gefrorenes Plasma herzustellen, die für eine Vielzahl von nachgelagerten Analysen geeignet sind. Wir haben auf besonders kritische Protokollschritte aufmerksam gemacht, die die Zentrifugation und Identifizierung der PBMC-Schicht in Schritt 2.5 und PBMC-Pellets in den Schritten 3.3 und 3.6 beinhalten. In der Vergangenheit sind klinische Stellen oft schief gelaufen, indem die Zentrifuge auf die richtigen Einheiten einstellt (ein RCF- oder x-g-Wert mit einem RPM-Wert verwechselt wird), wodurch die Verarbeitung von Blutproben, die Temperatur und das Vorhandensein großer Mengen PBS über dem gefrorenen Zellpellet verzögert werden. In den meisten Zentrifugenrotoren führt die irrtümliche Eingabe eines x-g-Wertes als Drehzahleinstellung zu einer signifikanten Unterzentrifugation mit einer daraus resultierenden schlecht definierten oder fehlenden PBMC-Schicht und zu einer möglichen versehentlichen PBMC-Entsorgung während der Waschschritte aufgrund ineffizienter Zellpelletierung. Es besteht jedoch die Möglichkeit, dass eine PBMC-Schicht trotz Verwendung der richtigen Zentrifugationseinstellungen und des Rotoradapters nicht sichtbar ist, wenn der Patient eine Leukopenie entwickelt hat. Dieser Zustand kann Patienten betreffen, die aufgrund einer Chemotherapie oder Strahlentherapie an onkologischen Studien teilnehmen, und sollte in Betracht gezogen werden. Ein weiterer kritischer Punkt, der im Protokoll klargestellt wurde, ist, dass die Proben innerhalb von 1-2 h nach der Blutentnahme verarbeitet werden müssen, um die Möglichkeit einer Hämolyse zu verringern, die sich negativ auf das Protokoll auswirkt. Darüber hinaus reduziert das Ziel, die Proben während der ersten Stunde der Blutentnahme zu verarbeiten, die Ex-vivo-Variabilität, die einen großen Einfluss auf pharmakokinetische Auslesungen und auf Biomarker haben kann, die von der Blutkonservierung oder aktiven Signalwegen betroffen sind, wie der in Abbildung 4gezeigte Fall . Verzögerungen bei der Probenverarbeitung können sich auch nachteilig auf die Zelllebensfähigkeit auswirken, wenn Zellen kryokonserviert werden34. Ein weiterer Faktor, der sowohl die Ausbeute als auch die Kontamination der roten Blutkörperchen beeinflussen kann, ist die Lager- und Zentrifugationstemperatur, die bei Raumtemperatur (18-25 °C) gehalten werden sollte. Niedrigere Temperaturen erhöhen die Dichte des Dichtegradientenmediums, was zu einem höheren Grad an roter Blutkörperchen und Granulozytenkontamination führt, da diese Zellen nicht so gut aggregieren. Auf der anderen Seite führen höhere Temperaturen dazu, dass PBMCs zwischen aggregierten Erythrozyten eingeschlossen werden, wodurch die Ausbeute der Zubereitung15,27,28verringert wird. Und schließlich ist es entscheidend, dass nicht mehr als 50-100 μL Flüssigkeit mit dem Zellpellet im Kryovial vorhanden sind, da dies die Konzentration von Proteinlysaten, die bei der Nachverarbeitung dieser PBMC-Präparate erhalten werden, negativ beeinflusst. Ein Überschuss an Flüssigkeit überdünnt Proben, was zu Lysaten mit sehr niedriger Proteinkonzentration führt, die für die Biomarkeranalyse nicht geeignet sind. Darüber hinaus wird die Erhaltung post translationaler Modifikationen beeinträchtigt und die Effizienz der Lyse wird ebenfalls stark reduziert.
Mononukleäre Zellpräparationsröhrchen wurden ausgewählt, da sie die einfachste Möglichkeit bieten, sowohl PBMCs als auch Plasma in einer einzigen Blutentnahme für klinische Studien mit unserer Erfahrung ausgezeichneter Reproduzierbarkeit zu isolieren. Die Blutverarbeitung erfordert keine gut ausgebildeten Bediener, und die Verwendung eines einzigen Röhrchens beseitigt die Notwendigkeit, das Blut zu verdünnen und in ein anderes Röhrchen zu übertragen, wodurch das Gefahrenrisiko verringert wird. verkürzt das Protokoll aufgrund der Durchführung der Zentrifugationsschritte mit eingeschalteten Bremsen; und alle Reagenzien befinden sich in der Röhre, was die Variabilität reduziert. Unserer Erfahrung nach überwiegen diese Vorteile die höheren Kosten dieser Röhrchen im Vergleich zu anderen klassischen Methoden, die nur die Verwendung eines Dichtegradiententrennmittels27,28 umfassen (£ 410 pro 60 Einheiten, während Lymphoprep Medium für 66 50-ml-Präparate £ 215 beträgt). Sie sind in zwei Arten von Antikoagulanzien erhältlich, Heparin und Citrat, die beide bei der Aufrechterhaltung der Funktionalität der isolierten PBMCs35vergleichbar sind, daher wird die Wahl eines Antikoagulans gegenüber dem anderen auf einem möglichen Einfluss von Heparin oder Citrat in den nachgelagerten Biomarkerstudien basieren. Während gezeigt wurde, dass EDTA-Röhrchen im Vergleich zu Heparin oder Citrat13die höchste PBMC-Isolationsausbeute bieten, gleicht der Vorteil der Benutzerfreundlichkeit der Reinrohrmanipulation diese Überlegung aus. Wenn Zytokine analysiert werden sollen, können Antikoagulanzien eine Wirkung auf die im Plasma nachgewiesenen Werte haben, daher sollten beide Antikoagulanzien getestet werden, bevor eines für die klinische Studie ausgewählt wird36. Wenn das Plasma für Metabolomik-Studien verwendet werden soll, wäre die Verwendung von Heparin als Antikoagulans bevorzugt37. Daher bleibt dem Endnutzer oder dem translationalen Wissenschaftler der klinischen Studie nur noch der Punkt, ob Citrat oder Heparin für ihre Zwecke besser geeignet ist, sobald die Kosten bewertet wurden.
Während die Vorteile der Verwendung von Zellpräparationsröhrchen im Vergleich zu den Einschränkungen, die sie darstellen (höhere Kosten und Verfügbarkeit einer begrenzten Palette von Antikoagulanzien), zahlreich sind, kann die Haupteinschränkung der Verwendung von PBMCs oder Plasma zur Gewinnung von PD-Biomarkern in klinischen Studien, insbesondere in der Onkologie, in keinem Zusammenhang mit der Isolationsmethode stehen. Mit Ausnahme von hämatologischen Krebsarten, bei denen der Tumor direkt aus peripherem Blut entnommen wird, sind Plasma und PBMCs bei anderen Krebsindikationen Ersatzgewebe, die den Primärtumor nicht unbedingt nachahmen. Peripheres Gewebe darf das Genom und epigenom nicht mit dem Primärtumor teilen, daher beschränkt sich die periphere Analyse von Biomarkern, die von einer spezifischen Tumormutation abhängig sind, hauptsächlich auf die ctDNA-Analyse (aus Plasma) oder CTCs (durch nachfolgende Sortierung der PBMC-Schicht). Darüber hinaus sind Signalkaskaden, die die Tumorproliferation antreiben oder dazu beitragen, im peripheren Blut möglicherweise nicht so aktiv. Diese Herausforderung kann durch die Anwendung von Biomarker-Entdeckungsansätzen für Blut8 zur Identifizierung alternativer Biomarker oder durch die Kopplung von Ex-vivo-Behandlungen mit der Isolierung von Plasma38 undPBMC-Präparaten 26überwunden werden.
Im aktuellen Protokoll können gefrorene PBMC-Pellets leicht außerhalb der klinischen Stelle verarbeitet werden, um Proteinlysate zu erhalten, die durch Western Blotting oder ELISA-Techniken bewertet werden können. Alternative Methoden zur Verwendung von PBMCs zur Aktivierung von IHC-Methoden wurden ebenfalls vorgestellt (Supplementary File). Darüber hinaus haben wir auch die Möglichkeit der Kryokonservierung von PBMCs (siehe Ergänzungsdatei)für das Immunzellmonitoring, eine relevante Anwendung in der Onkologie, mit Immun-Checkpoint-Inhibitoren und ADCs, die zunehmend in klinischen Studien getestet werden, detailliert beschrieben. Die Beurteilung von Immunfunktionen wie ADCC16 und Immunphänotypisierung sind Anwendungen, die mit kryokonservierten PBMCs kompatibel sind, die aus mononukleären Zellpräparationsröhrchen isoliert wurden15. Es gibt einen Vorbehalt bei der Kryokonservierung, da sie die Herunterregulierung bestimmter Oberflächen- und interner Marker fördern und bestimmte Zellfunktionen beeinträchtigen kann, jedoch ist die PBMC-Kryokonservierung der einzige praktikable Weg, um diese Assays aufgrund von Zeitbeschränkungen bei der Handhabung von Proben von mehreren klinischen Standorten bis zur Verarbeitung in externen Laborsdurchzuführen 14,15, und diese nachteiligen Auswirkungen können durch gute Auftaumethoden und Ruhezeiten erheblich überwunden werden39.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das hier bereitgestellte Protokoll die zuverlässige Vorbereitung von PBMCs und Plasmaproben in jeder klinischen Einrichtung mit gemeinsamen Geräten und Materialien ermöglicht, so dass translationale Endpunkte aus peripherem Blut in globalen klinischen Studien robust ermöglicht werden können.
Schließlich zeigen wir, wie die Analyse von PBMC-Lysaten die Reaktion auf DNA-schädigende Wirkstoffe mechanistisch beeinflussen kann, indem eine dosisabhängige post-translationale Modifikation wichtiger DDR-Faktoren gezeigt wird, die zur Gestaltung der klinischen Entwicklung verwendet werden kann. Eine vorausschauende Implementierung von Methoden, die quantitativer sind als Western Blotting (z.B. Massenspektrometrie40)und weniger Inputmaterial benötigen (wie kapillares Western Blotting und ELISA), würde dazu beitragen, diese präklinischen Ergebnisse in Richtung einer robusteren, systematischeren Auswertung von PBMC-Patientenproben zu bewegen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken allen Mitgliedern der Translational Medicine bei AstraZeneca Oncology Research and Early Development für ihr Feedback zum Protokoll, insbesondere Hedley Carr, Tammie Yeh und Nathan Standifer für ihre Beratung zur Plasmavorbereitung für die ctDNA-Analyse, zur PBMC-Isolierung und zur PBMC-Kryokonservierung bzw. Immunphänotypisierung.
Materials
| 1.5 mL cryovial | Nalgene, ThermoFisher | 5000-1020 | To store PBMC pellets and re-suspended PBMCs |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 525-0990 | This is an example, use your preferred provider |
| 15 mL conical sterile propylene centrifuge tube | Nunc, ThermoFisher | 339651 | Other brands can be used |
| 2 mL screw cap tube sterile, with attached cap | ThermoFisher | 3463 | For plasma aliquoting |
| 20X TBS Buffer | ThermoFisher Scientific | 28358 | Final is 25 mM Tris, 0,15 M NaCl; pH 7,5. This is an example, you can prepare your own stock or use a different provider |
| 20X TBS Tween 20 Buffer | ThermoFisher Scientific | 28360 | Or supplement TBS with 0.05% to prepare TBST buffer |
| Automated cell counter or haemocytometer | ThermoScientific | AMQAX1000 | We use Countess device and slides but could be other methods. |
| Adjustable micropipette allowing 50 µL measurements | To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes) | ||
| BD Vacutainer CPT mononuclear cell preparation tube (Na-citrate or Na-heparin) 8 mL | BD | 362761, 362753 | There are 4 mL tubes but if possible 8 mL tubes are recommended to obtain more PBMCs from a single blood draw |
| Cell-freezing box | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | This is an example, use your preferred provider. |
| Centrifugation unit converter | LabTools | http://www.labtools.us/centrifugation-speed-rpm-to-g-conversion/ | |
| DMSO | Sigma-Aldrich, MERK | D2438 | Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation |
| ECL horseradish peroxidase substrate | ThermoFisher | 34075 | Use your preferred reagent according to the sensitivity required to detect your biomarker by western blot. Other systems can be used such as IRDye secondary antibodies with imaging systems. |
| Faxitron MultiFocus X-ray cabinet | Faxitron Bioptics | To irradiate blood. Other models/makers are available | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated | ThermoScientific | 102706 | Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation |
| Fine tip, sterile 1.5 mL Pasteur pipettes | VWR | 414004-018 | Optional |
| Fixed-angle rotor centrifuge | Optional for preparation of plasma for ctDNA/metabolomics | ||
| Gel doc imaging system | SYNGENE | For imaging HRP developed membranes | |
| Heat block | To denature lysates prior to run them in western blot, any maker equipped with suitable tube adaptors | ||
| Horizontal rotor (swing-out head) centrifuge | Thermoscientific | Heraeus Megafuge 40R | This is an example |
| Liquid nitrogen/dry ice | To flash-freeze samples | ||
| Marvel dried skimmed milk | Premier Foods | This is an example, use your preferred provider | |
| Micropipette tips for range 1-200 µL | To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes) | ||
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris protein gel, 1 mm, 10 wells | ThermoFisher Scientific | NP0321BOX | This is an example, cast your own or use your preferred provider |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFisher Scientific | NP0007 | For imaging HRP developed membranes |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | ThermoFisher Scientific | NP0009 | This is an example. |
| PBS, no calcium, no magnesium | Gibco, ThermoFisher | 14190-144 | This is usually provided in the clinical kit. |
| Phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma-Aldrich, MERK | P5726-1ML | Optional for step 3.7 |
| Phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma-Aldrich, MERK | P0044-1ML | Optional for step 3.7 |
| Rabbit anti GAPDH | Cell Signaling Technology | CST 2128 | 1:1000 dilution in 5% milk TBST |
| Rabbit anti γH2AX | Cell Signaling Technology | CST 2577, lot 11 | 1:2000 dilution in 5 % milk TBST |
| Rabbit anti pS1981 ATM | Abcam | ab81292 | 1:2000 dilution in 5 % milk TBST |
| Rabbit anti pS635 RAD50 | Cell Signaling Technology | CST 14223 | 1:1000 dilution in 5 % milk TBST |
| Rabbit anti total ATM | Abcam | ab32420 | 1:1000 dilution in 5 % milk TBST |
| Rabbit anti total RAD50 | Cell Signaling Technology | CST 3427, lot 2 | 1:1000 dilution in 5 % milk TBST |
| RIPA buffer | Sigma-Aldrich, MERK | R0278-50ML | For cell lysis. This is an example, use your preferred provider |
| Sonicator | Diagenode | B01060010 | Used for 3 cycles at 30 s on/ 30 s off, 4 oC. If using a different instrument, adjust number of cycles and intensity according to your sonicator. |
| Sterile 1.7 mL Pasteur pipettes | VWR | 414004-030 | This is an example, use your preferred provider |
| Sterile serological pipettes (5 and 10 mL volume) | Costar | 4101, 4051 | This is an example, use your preferred provider |
| Trypan blue | ThermoScientific | T10282 | This is for the automated cell counter listed above. |
| Wet ice | To keep plasma samples and lysates cold |
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